響應(yīng)面法在靈芝深層發(fā)酵產(chǎn)靈芝酸優(yōu)化中的應(yīng)用

鮑 銳， 陳中凱， 劉 玲， 王松華

(安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

靈芝[Ganodermalucidum(Fr.) Krast]在中國、日本和韓國等亞洲國家有兩千多年的應(yīng)用歷史。其既可以食用，又可以入藥，具有強(qiáng)健精神、活血通經(jīng)、延年益壽、美容等效果。靈芝子實(shí)體中含有多種活性成分(三萜類、多糖類、甾醇類、氨基酸類、生物堿類、有機(jī)鍺等)，在民間稱為“靈丹妙藥”或者“仙草”[1]，其中靈芝酸是野生或人工栽培的靈芝子實(shí)體、孢子粉、菌絲體中的主要的天然藥理活性物質(zhì)。后者為一種高度氧化的四環(huán)三萜類甾醇化合物，具有抗癌癥、抗HIV、抗衰老、抗氧化、降血糖、降血脂和降血壓等藥理和生理功能，在臨床醫(yī)療和日常衛(wèi)生保健方面有著廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)需求量[2]。目前，在醫(yī)療保健行業(yè)中靈芝酸提取的主要來源是靈芝子實(shí)體，由于野生靈芝越來越少，不得不采用人工栽培方法培養(yǎng)靈芝子實(shí)體。然而，在不同生長環(huán)境條件下栽培出來的靈芝活性成分存在差異而導(dǎo)致藥理作用不同，質(zhì)量無法保證，且耗工、耗時(shí)、生長周期長。靈芝酸的另一種來源是從液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌絲體中提取，該法的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)條件易控制、耗時(shí)短、活性成分穩(wěn)、靈芝酸純度高等。然而，常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的菌絲體生物量和靈芝酸含量偏低，仍然無法滿足工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)和日益增長市場(chǎng)需求，從而大大地制約了靈芝酸在醫(yī)療保健領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。對(duì)液體發(fā)酵法產(chǎn)靈芝酸的研究表明，在靈芝菌絲對(duì)數(shù)生長期之后向培養(yǎng)基中添加一定濃度的外源物質(zhì)如褪黑素、一氧化氮、木質(zhì)素、乙酸、鈣離子和銅離子等均能夠促進(jìn)靈芝酸的生物合成[2-4]。然而，相關(guān)分研究結(jié)果只涉及靈芝酸濃度的改變，而對(duì)于深層發(fā)酵靈芝酸產(chǎn)量是否提高關(guān)注較少。

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design Expert設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)CaCl2、CuSO4和褪黑素(melationin)等3種誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，采用響應(yīng)面法(Response Surface Methodology)對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行分析，獲得因子最佳組合方案，目的是在增加靈芝酸濃度的同時(shí)也提高菌絲體生物量，從而實(shí)現(xiàn)靈芝酸產(chǎn)量增加，為其發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

靈芝菌種(Ganodermalucidum)由安徽科技學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 菌種培養(yǎng)

菌種活化：將保存的靈芝菌種接種于由瓊脂 15 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、馬鈴薯200 g/L組成的斜面培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d；種子培養(yǎng)基培養(yǎng)：將活化的菌絲接種至由酵母浸出粉10 g/L、玉米粉4 g/L、馬鈴薯200 g、KH2PO41 g/L、MgSO41 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L組成的種子液培養(yǎng)基中，于28 ℃，150 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)8 d，用分散器打碎。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MgSO40.5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L、KH2PO41 g/L、水1 000 mL、pH自然)中按接種量5%接種，250 mL三角錐形瓶中裝液量100 mL，28 ℃，150 r/min培養(yǎng)4 d后，添加50、100、200、400、600、800 μmol/L氯化鈣溶液，或者添加50、100、200、400、600、800 μmol/L硫酸銅溶液，或者添加10、20、30、50、100、200 μmol/L褪黑素溶液。于28 ℃，150 r/min繼續(xù)培養(yǎng)4 d，發(fā)酵液離心，收集菌絲體。對(duì)照組接種量以5%接種在基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基；28 ℃，150 r/min，培養(yǎng)8 d。

1.3.2 響應(yīng)面最優(yōu)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 配制基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基并分成18組，在前期單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design Expert軟件設(shè)計(jì)，得出各組誘導(dǎo)劑濃度試驗(yàn)方案。按接種量5%接種；250 mL三角錐形瓶中裝液量100 mL，28 ℃，150 r/min培養(yǎng)4 d后，加入100 mmol/L褪黑素母液、1 mol/L CaCl2母液和1 mol/L CuSO4母液，使終濃度達(dá)到試驗(yàn)方案中各組對(duì)應(yīng)的濃度，于28 ℃，150 r/min繼續(xù)培養(yǎng)4 d,發(fā)酵液離心，收集菌絲體。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表

1.4 生物量測(cè)定

將靈芝菌絲發(fā)酵液及菌絲體置于離心管中，在5 800 r/min離心8 min，丟棄上清液，將菌絲體沉淀置于-50 ℃真空冷凍機(jī)中干燥至恒重，研磨為粉末，稱量即得生物量。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

精密稱取5.0 mg熊果酸(分析純)，溶解于50.0 mL色譜純乙醇中，充分混勻即為100 mg/L熊果酸標(biāo)準(zhǔn)液。取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)液于15 mL試管(加蓋)，于室溫下?lián)]發(fā)掉乙醇，添加5%香草醛-冰乙酸0.40 mL、高氯酸1.0 mL，在加熱65 ℃下15 min，室溫下靜置15 min，添加預(yù)冷冰乙酸5.0 mL，蓋緊試管蓋上下顛倒充分搖勻，室溫下靜置20 min，在547.5 nm波長下測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)、熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/L)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.007 4x+0.084 2(R2=0.996 2)。

1.6 靈芝酸提取與測(cè)定

準(zhǔn)確稱量干燥菌絲粉末0.1 g，加入10 mL 100%乙醇，常溫超聲波3 h，6 000 r/min 離心，20 min，小心量取上清液5 mL，再次浸提3次，將所有的上清液合并混勻。按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)量菌絲粉末中靈芝酸含量S，并通過以下公式計(jì)算靈芝酸產(chǎn)量：G=S×H/(P×V)(G：靈芝酸產(chǎn)量，mg/L；S：樣品靈芝酸含量mg/g；H：菌絲體總干重g；V：發(fā)酵液體積L；P：樣品干重g)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.5軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS 19.0分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度CaCl2、CuSO4和褪黑素對(duì)深層發(fā)酵靈芝酸產(chǎn)量的影響

在擴(kuò)大培養(yǎng)第4天時(shí)分別加入不同濃度的CaCl2、CuSO4和褪黑素作為誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)至第8天收獲，測(cè)定菌絲體生物量和靈芝酸含量，并計(jì)算靈芝酸產(chǎn)量。

圖1 不同濃度CaCl2、CuSO4和褪黑素對(duì)靈芝酸產(chǎn)量的影響

結(jié)果表明，CaCl2濃度為100和200 μmol/L時(shí)，靈芝酸產(chǎn)量(圖1A)顯著提高，達(dá)到187.061 mg/L和182.407 mg/L，是對(duì)照組的1.29和1.26倍；發(fā)酵液中CuSO4為100 μmol/L時(shí)，靈芝酸產(chǎn)量比對(duì)照組增加了57%，在CuSO4試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)為最大值(圖1B)；褪黑素濃度在10～100 μmol/L時(shí)，靈芝酸產(chǎn)量均(P<0.05)大于對(duì)照組(圖1C)，靈芝酸產(chǎn)量最高(244.528 mg/L)時(shí)的褪黑素濃度為20 μmol/L(圖1C)。鑒于此，響應(yīng)面法設(shè)計(jì)選取CaCl2濃度為100～200 μmol/L、CuSO4濃度為50～100 μmol/L、褪黑素濃度為10～20 μmol/L。

2.2 氯化鈣、硫酸銅、褪黑素對(duì)靈芝酸產(chǎn)量的影響

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)，以A(CaCl2)、B(CuSO4)、C(褪黑素)等為三個(gè)影響因素，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)(表1)，使用Designer-Expert 8.0.5 軟件設(shè)計(jì)共17個(gè)試驗(yàn)組，進(jìn)行靈芝菌絲體培養(yǎng)，測(cè)定靈芝酸含量和菌絲生物量，計(jì)算靈芝酸產(chǎn)量Y作為響應(yīng)值，并進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，研究結(jié)果如表2所示。

使用 Designer-Expert 8.0.5 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到A(CaCl2)、B(CuSO4)、C(褪黑素)為自變量、靈芝酸產(chǎn)量(YGA)為因變量的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

YGA=406.75+3.77A+10.33B+9.08C-12.26AB-0.57AC-27.46BC+13.33A2+1.83B2+1.60C2

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

為研究影響靈芝酸產(chǎn)量的3種誘導(dǎo)劑之間的相互作用關(guān)系，確定其對(duì)深層發(fā)酵靈芝酸產(chǎn)量的影響程度，檢測(cè)二元回歸方程準(zhǔn)確性，使用 Designer-Expert 8.0.5 軟件對(duì)二元回歸方程進(jìn)行方差分析。由表3可知，二元回歸方程模型達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，失擬項(xiàng)0.336 2，表示失擬性在水平上不顯著，該模型選取合適；方程復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.919 7，說明該模型能解釋91.97%響應(yīng)值的變化，表明該模型擬合程度較好，可以采用該模型對(duì)靈芝酸產(chǎn)量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。從表中F值和P值可以看出，CuSO4(A)對(duì)靈芝酸產(chǎn)量的影響程度最大，褪黑素(C)次之，CaCl2(B)影響最?。煌屎谒?C)和CuSO4(A)對(duì)靈芝酸產(chǎn)量影響達(dá)到極顯著水平，CaCl2(A)則不顯著。此外，A、B、C對(duì)靈芝酸產(chǎn)量的影響不是簡單一次函數(shù)關(guān)系，交互項(xiàng)AB和BC對(duì)靈芝酸產(chǎn)量的影響達(dá)到顯著水平，表明CaCl2與CuSO4之間互作(AB)、CuSO4與褪黑素之間的互作(BC)對(duì)深層液體發(fā)酵靈芝酸產(chǎn)量有顯著影響。

圖2A為影響靈芝酸產(chǎn)量的CaCl2濃度固定為零水平，即CaCl2濃度為150 μmol/L時(shí)，CuSO4和褪黑素交互作用對(duì)靈芝酸產(chǎn)量影響。由圖2A可知，曲面較陡，二者交互作用等高線沿CuSO4軸方向變化相對(duì)密集，等高線呈明顯曲面，表明其交互作用強(qiáng)。圖2B為CuSO4濃度固定為零水平，即CuSO4濃度為75 μmol/L時(shí)，CaCl2和褪黑素交互作用對(duì)靈芝酸產(chǎn)量影響，CaCl2曲面平滑，表明對(duì)靈芝酸產(chǎn)量無顯著影響，而褪黑素濃度對(duì)靈芝酸產(chǎn)量的影響較顯著(圖2B)。圖2C為褪黑素濃度固定為零水平，即褪黑素濃度為15 μmol/L時(shí)，CaCl2和CuSO4交互作用對(duì)靈芝酸產(chǎn)量影響，其中CuSO4曲面較陡，表明其靈芝酸產(chǎn)量的影響較顯著，而CaCl2濃度曲面平滑，對(duì)靈芝酸產(chǎn)量無顯著影響。分析軟件Designer-Expert 8.0.5得出最佳靈芝酸產(chǎn)量試驗(yàn)方案為：褪黑素20 μmol/L、CaCl2200 μmol/L、CuSO450 μmol/L，預(yù)測(cè)靈芝酸產(chǎn)量為465.19 mg/L。

表3 回歸模型方差分析

圖2 CaCl2、CuSO4和褪黑素對(duì)靈芝酸產(chǎn)量的交互影響

2.3 試驗(yàn)驗(yàn)證

對(duì)優(yōu)化得到的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，在培養(yǎng)4d時(shí)向靈芝液體培養(yǎng)基添加200 μmol/L氯化鈣、50 μmol/L硫酸銅、20 μmol/L褪黑素(試驗(yàn)組)，對(duì)照組不添加任何誘導(dǎo)劑，各設(shè)置3個(gè)平行組試驗(yàn)，繼續(xù)培養(yǎng)至8 d，得到對(duì)照組靈芝酸平均產(chǎn)量為156.42 mg/L，試驗(yàn)組靈芝酸平均產(chǎn)量為451.92 mg/L，與理論預(yù)測(cè)值接近(相對(duì)誤差0.29%)，且高于表2試驗(yàn)結(jié)果的靈芝酸最高產(chǎn)量444.63 mg/L，證明響應(yīng)面優(yōu)化的深層液體發(fā)酵靈芝酸產(chǎn)量模型可行。

3 結(jié)論與討論

在液體培養(yǎng)基中添加外源物質(zhì)(如金屬離子Mn2+、Cu2+、Ca2+，植物激素水楊酸、茉莉酸甲酯、一氧化氮等)促進(jìn)植物和微生物次生代謝產(chǎn)物生物合成是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和醫(yī)療保健領(lǐng)域研究的熱門課題[5]。近年來的文獻(xiàn)報(bào)道顯示，在靈芝深層液體發(fā)酵過程中添加適量的外源物質(zhì)能不同程度地提高靈芝酸含量和菌絲體生物量[2,6]。Zhang等[7]在培養(yǎng)液中入5 mg/L的纖維酶(cellulase)能顯著提高靈芝酸含量和靈芝酸產(chǎn)量，分別達(dá)到3.55 mg/100 mg和1 252.7 mg/L；10 mmol/L Ca2+顯著提高靈芝酸-Mk、T、S、Me等的含量[8]，菌絲體總靈芝酸含量比對(duì)照組高278%, 靈芝酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因GL-sqs、GL-hmgr、GL-ls表達(dá)均有不同程度的顯著上調(diào)；Tang等[9]的研究表明，在深層發(fā)酵培養(yǎng)靈芝菌絲至第4天時(shí)添加1 mmol/L Cu2+能夠提高靈芝酸含量。然而本研究的結(jié)果表明，50～100 μmol/L Cu2+和100～200 μmol/L Ca2+能顯著提高靈芝酸產(chǎn)量(圖1A、圖1B)，高濃度的Cu2+和Ca2+離子則抑制靈芝酸的生物合成。這可能是因?yàn)?，Tang等[9]是采用兩階段培養(yǎng)方法，先搖床培養(yǎng)再進(jìn)行靜置培養(yǎng)，在靜置培養(yǎng)階段施以Cu2+或者Ca2+進(jìn)行處理。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在深層發(fā)酵培養(yǎng)靈芝菌絲至第4天時(shí)添加20 μmol/L褪黑素能夠顯著提高靈芝酸含量和產(chǎn)量[10]。

本文采用響應(yīng)面優(yōu)化法研究了Ca2+、Cu2+、褪黑素3個(gè)誘導(dǎo)劑因素相互作用對(duì)靈芝深層發(fā)酵靈芝酸產(chǎn)量的影響，同時(shí)對(duì)三個(gè)因素三個(gè)水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)，快速準(zhǔn)確地確定深層發(fā)酵靈芝酸產(chǎn)量達(dá)到最大值的條件為褪黑素20 μmol/L、CaCl2200 μmol/L、CuSO450 μmol/L，靈芝酸產(chǎn)量為451.92 mg/L。本研究的結(jié)果顯示，Ca2+、Cu2+、褪黑素三者對(duì)于對(duì)于靈芝酸產(chǎn)量的影響，存在著交互作用，這可能與三者在靈芝酸生物合成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中處于不同上下游位置有關(guān)系。有研究表明，Ca2+是動(dòng)植物和微生物中廣泛存在的第二信號(hào)分子，在生物細(xì)胞面對(duì)各種紛繁復(fù)雜快速變化的環(huán)境因子應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著樞紐作用，參與真菌分生孢子形成、形態(tài)分化和次生代謝產(chǎn)物的生物合成等過程[11]。 Xu等[8]的研究表明，Ca2+通過鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)3個(gè)靈芝酸生物合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控靈芝酸的生物合成。在靈芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Cu2+、Na+和Mn2+等金屬離子可以引起細(xì)胞鈣內(nèi)流，進(jìn)而上調(diào)靈芝酸生物合成。目前，有關(guān)靈芝酸生物合成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究均發(fā)現(xiàn)，Ca2+通常位于水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、活性氧(ROS)和金屬離子等信號(hào)分子的下游，信號(hào)傳遞鏈大致如下：Cu2+、Na+和Mn2+等金屬離子-Ca2+離子-Ca·CaM(鈣調(diào)素蛋白)-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-靈芝酸生物合成關(guān)鍵酶基因(GL-sqs、GL-hmgr、GL-ls)-靈芝酸, 或者是：SA/MeJA-ROS-Ca2+離子-Ca·CaM(鈣調(diào)素蛋白)-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-靈芝酸生物合成關(guān)鍵酶基因(GL-sqs、GL-hmgr、GL-ls)-靈芝酸[12]。由此可見，在誘導(dǎo)靈芝酸生物合成的信號(hào)傳遞鏈中，Ca2+離子與Cu2+離子存在著協(xié)同關(guān)系，Ca2+位于Cu2+的下游，這與本研究A(CaCl2)、B(CuSO4)之間存在互作相一致，具體分子生物學(xué)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。