BDE-209對斑馬魚腸道的慢性毒性效應

王京，閆振廣，張?zhí)煨?，王晶，李娟?/p>

1.上海海洋大學海洋生態(tài)與環(huán)境學院

2.環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室, 中國環(huán)境科學研究院

3.中國環(huán)境科學研究院水生態(tài)環(huán)境研究所

多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）是目前廣泛使用的溴化阻燃劑。由于低負荷、成本低廉且阻燃效率高，PBDEs被廣泛添加到消費品和材料中，以滿足消防安全法規(guī)的要求[1]。PBDEs的商業(yè)產(chǎn)品主要有3種，包括五溴聯(lián)苯醚（penta-BDE）、八溴聯(lián)苯醚（octa-BDE）和十溴聯(lián)苯醚（deca-BDE）[2]。研究表明，PBDEs能借助大氣和水等暴露介質(zhì)進行遠距離遷移，具有較強的環(huán)境持久性、生物富集性和一定的生物毒性，因此許多國家和地區(qū)都限制或禁止其生產(chǎn)和使用[3-5]。截至2019年，所有PBDEs商業(yè)產(chǎn)品均被《斯德哥爾摩公約》列為有害物質(zhì)[3]。盡管我國已禁用五溴和八溴聯(lián)苯醚商業(yè)產(chǎn)品，但對十溴聯(lián)苯醚產(chǎn)品卻并未禁止[6]。BDE-209是十溴聯(lián)苯醚商業(yè)產(chǎn)品的主要成分，也是我國環(huán)境介質(zhì)中最常檢出的PBDEs單體同系物[3]。鑒于接觸PBDEs會對動物和人類造成重大的潛在健康風險，因此有必要探究其慢性暴露所產(chǎn)生的毒害效應。

流行病學和毒理學研究表明，PBDEs具有內(nèi)分泌干擾毒性、神經(jīng)毒性以及生殖發(fā)育毒性等一系列毒性效應[7-8]。長期暴露在PBDEs環(huán)境中，會破壞機體性激素和甲狀腺激素的動態(tài)平衡，產(chǎn)生毒害作用[9-10]。在高劑量暴露時，PBDEs還表現(xiàn)出肝毒性、免疫毒性和一定程度的致畸效應[11-13]。最近研究還發(fā)現(xiàn)，BDE-209暴露可通過氧化應激干擾小鼠肝臟的脂質(zhì)代謝，并激活mTOR/PPARγ/RXRα信號通路[14]。Li等[15]發(fā)現(xiàn)BDE-209暴露會改變C57BL/6小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)并破壞膽囊酸的穩(wěn)態(tài)。然而，關(guān)于PBDEs對腸道組織的直接毒害作用卻知之甚少。腸道不僅是生物體的重要消化代謝器官，也是最大的免疫器官，在生長發(fā)育、生物屏障、免疫調(diào)節(jié)以及糖脂代謝等生理功能和過程中起著至關(guān)重要的作用[16-17]。腸道組織受損害將直接導致宿主機體功能受損和疾病[18]。健康風險研究發(fā)現(xiàn)，飲食暴露是PBDEs較為重要的暴露途徑，PBDEs通過在食品中積累進入生物體，從而使腸道組織直接暴露于PBDEs中[3,19]。鑒于BDE-209在環(huán)境介質(zhì)中大量且長期存在，其對腸道的致毒效應值得探究。

斑馬魚（Danio Rerio）是一種小型硬骨魚，易于飼養(yǎng)和繁殖[20-21]。斑馬魚的基因與人類的基因高度相似，且斑馬魚和哺乳動物之間在腸道許多代謝功能與免疫功能上也是高度保守的，是研究腸道損傷和毒害作用的理想模式生物[22-23]。研究表明，斑馬魚胚胎暴露于80 μg/L BDE-209溶液14 d后，其體內(nèi)甲狀腺激素和下丘腦-垂體-甲狀腺（HPT）軸基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了顯著改變[24]。稀有鮈鯽成年雄魚暴露于10 μg/L BDE-209溶液21 d后，睪丸出現(xiàn)精子生成抑制現(xiàn)象，且肝臟甲狀腺通路相關(guān)基因和睪丸凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生組織特異性改變，BDE-209暴露影響了稀有鮈鯽成年雄魚甲狀腺健康和正常的生殖功能[25]。考慮到成魚和胚胎對污染物耐受程度的不同以及組織間的特異性，筆者將成年雄性斑馬魚分別暴露于6、60和600 μg/L的BDE-209溶液中28 d，通過對斑馬魚腸道組織變化、氧化應激、炎癥反應以及腸道屏障、炎癥和凋亡相關(guān)基因的研究，探討B(tài)DE-209對斑馬魚腸道健康的潛在影響，以期為BDE-209對腸道的毒性效應及分子機制研究提供科學支持。

1 材料與方法

1.1 化學品與試劑

BDE-209（CAS: 1163-19-5，純度＞98%）購自百靈威化學科技有限公司。二甲基亞砜（DMSO，CAS:67-68-5，HPLC級，純度＞99.9%）購自上海麥克林生化科技有限公司。將BDE-209粉末溶解在DMSO中，得到2 g/L的儲備原液。為避免光解，每隔2 d用DMSO重新配制儲備原液，并將其儲存在密封的棕色玻璃試劑瓶中。DMSO在測試溶液中的最終濃度不超過0.05%。

1.2 斑馬魚馴養(yǎng)和BDE-209暴露

純種AB系雄性斑馬魚(120 d)來自中國環(huán)境科學研究院水生生物養(yǎng)殖室，馴養(yǎng)在(28±1)℃的循環(huán)水系統(tǒng)中，光暗周期為14 h∶10 h，循環(huán)水為充分曝氣并過濾脫氯的自來水。水質(zhì)參數(shù)：pH為7.0～7.5，溶解氧（DO）濃度為（6.9±0.5）mg/L，電導率為（0.256±0.005）mS/cm，水的硬度為（185±9）mg/L（以 CaCO3計）。在正式毒性暴露前，斑馬魚被馴養(yǎng)14 d。在此期間，斑馬魚每天被喂食一次新鮮孵化的豐年蝦。

將馴化后的斑馬魚隨機分為4組：對照組（0.05% DMSO溶劑對照）以及6、60 和600 μg/L BDE-209暴露組。每組包括3個重復玻璃水箱，每個水箱有20條雄性成魚暴露在20 L的指示溶液中。暴露期間每天固定時間喂斑馬魚1次，每天更新暴露介質(zhì)以保持適當?shù)幕瘜W濃度，其他條件均與馴養(yǎng)期保持一致。暴露28 d后，對所有魚類實施安樂死，解剖并收集腸道組織。每組隨機取出1條魚的腸道，將這4條完整的成年斑馬魚腸道浸泡在4%多聚甲醛中固定，用于后續(xù)組織病理學分析。隨后每個水箱隨機取10條腸道，混合5條腸道作為1份樣本，每組共采集6份樣本，立即將其冷凍在液氮中并保存在-80 ℃下，用于后續(xù)分子生物學分析。

1.3 腸道組織病理學分析

將收集到的完整腸道置于4 ℃ 4%多聚甲醛中固定24 h，隨后依次用70%、80%、90%和100%的乙醇對腸道組織進行脫水，經(jīng)組織透明、浸蠟、包埋等常規(guī)操作后，將包埋塊固定在標本夾持器上，取腸道的中腸部位切成厚4～5 μm的切片。切片經(jīng)脫蠟，蘇木精-伊紅（H & E）染色后，進行脫水封片，在顯微鏡（Nikon Eclipse E100，日本）下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.4 生物化學分析

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）以及丙二醛（MDA）的含量使用市購試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）按照制造商的說明進行測定。SOD能催化超氧陰離子自由基（）的分解。能還原氮藍四唑生成藍色甲臜，后者在560 nm處被吸收；SOD可清除，從而抑制了藍色甲臜的形成。根據(jù)反應溶液在560 nm處的吸光度來判斷SOD的含量。H2O2在240 nm下有特征吸收峰，CAT能夠分解H2O2，使反應溶液240 nm下的吸光度隨反應時間而下降，根據(jù)吸光度的變化率計算出CAT的含量。MDA與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，產(chǎn)物在532 nm處有一個最大的吸收峰，但其吸收峰因可溶性糖而改變。因此，同時測量600、532和450 nm處的吸收峰，根據(jù)差值計算MDA的含量。

1.5 腸道內(nèi) ROS、TNF-α、IL-1β 和 LPS 水平的測定

將斑馬魚腸道組織與適量的生理鹽水混合勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清液，根據(jù)活性氧（ROS）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白細胞介素 1β（IL-1β）和脂多糖（LPS）各自的 ELISA 試劑盒（北京飛默生物科技有限公司）測定其總含量。在450 nm波長下，用酶標儀（SpectraMax i3x，Molecular Devices，美國）測定吸光度（OD）。最后繪制各因子的線性回歸曲線，并根據(jù)曲線方程計算各樣品的含量。

1.6 實時熒光定量PCR分析

使用Trizol裂解試劑（Invitrogen，美國）從腸道組織樣本中提取總RNA。RNA的完整性和純度分別通過1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop One平臺（Thermo Scientific，美國）上的讀數(shù)進行檢測。用RQ1 RNase-Free DNase（Promega，美國）從 RNA 提取物中去除污染物DNA后，使用商業(yè)化反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海翌圣生物科技有限公司）合成cDNA。采用SYBR Green試劑盒（上海翌圣生物科技有限公司）在ABI 7 300 plus real-time PCR檢測平臺（Thermo Scientific，美國）上進行實時熒光定量PCR分析。利用Primer 3軟件設計了腸道屏障功能、炎癥、凋亡關(guān)鍵相關(guān)基因的引物序列，相關(guān)序列如表1所示。利用2-ΔΔCT方法將目標基因的轉(zhuǎn)錄水平與核糖體蛋白L8（rpl8）管家基因的轉(zhuǎn)錄水平進行歸一化來評估基因的相對表達量[26]。

表1 實時熒光定量PCR分析中使用的目標基因引物的序列Table 1 The sequences of target genes primer pairs used in the RT-qPCR analysis

1.7 統(tǒng)計分析

本研究中的數(shù)值為3個重復的平均值±標準誤差（SEM）。數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性和方差的均勻性分別用Turkey和Levene’s檢驗進行評價。組間差異采用單因素方差分析和事后比較進行顯著性檢驗。使用Origin 2021軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。P＜0.05為統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 BDE-209對腸道組織形態(tài)的影響

通過H & E染色觀察BDE-209對斑馬魚腸道組織形態(tài)學的影響（圖1）。腸壁和腸絨毛的完整性是衡量腸道健康的重要指標。H & E染色顯示，28 d暴露后，BDE-209對斑馬魚腸道組織有明顯的損傷作用。與對照組相比，暴露組腸道的腸壁厚度明顯變薄，且在腸壁外縱肌部位開始出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象〔圖1（c）、圖1（f），紅色箭頭〕，600 μg/L 暴露組還觀察到腸壁破損〔圖1（d），紅色箭頭〕。暴露組腸絨毛也出現(xiàn)了明顯的損傷，與對照組相比，60和600μg/L暴露組腸絨毛內(nèi)部出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象〔圖1（g）、圖1（h），藍色箭頭〕，6 μg/L 暴露組觀察到腸絨毛纖毛輕微破損〔圖1（f），綠色箭頭〕，600 μg/L 暴露組觀察到腸絨毛纖毛嚴重破損〔圖1（h），綠色箭頭〕。

圖1 斑馬魚腸道切片蘇木精-伊紅 (H & E) 染色后的組織形態(tài)Fig.1 Tissue morphology after haematoxylin-eosin (H & E) staining in intestinal sections from zebrafish

2.2 BDE-209對氧化應激相關(guān)指標的影響

BDE-209暴露對腸道氧化應激相關(guān)指標的影響如圖2所示。與對照組相比，6 μg/L BDE-209暴露后ROS含量雖上升，但變化并沒有顯著差異，而60和600 μg/L暴露組ROS含量顯著升高。此外，不同濃度的BDE-209暴露還造成了腸道組織內(nèi)MDA含量的顯著上升，差異均有統(tǒng)計學意義。值得注意的是，不同濃度的BDE-209暴露還造成了斑馬魚腸道內(nèi)CAT含量的顯著升高。6 μg/L BDE-209暴露下雖未造成SOD含量的顯著升高，但60和600μg/L暴露組與對照組有顯著差異。與60 μg/L暴露組相比，600 μg/L暴露組的SOD含量略有下降。

圖2 BDE-209暴露后斑馬魚腸道內(nèi)ROS、MDA、SOD和CAT含量變化Fig.2 Changes of ROS, MDA, SOD and CAT contents in the intestine of zebrafish after exposure to BDE-209

2.3 BDE-209對炎癥相關(guān)指標的影響

BDE-209暴露后腸道內(nèi) TNF-α、IL-1β 和 LPS含量變化如圖3所示。28 d暴露后，各暴露組TNF-α含量相較于對照組均有顯著上升，IL-1β含量也有隨暴露濃度的升高顯著上升的趨勢，提示腸道內(nèi)有炎癥的發(fā)生。此外，60和600 μg/L暴露組還觀察到了腸道內(nèi)LPS的顯著上升，表明高濃度BDE-209暴露后會增加腸道組織內(nèi)毒素的含量。與對照組相比，6 μg/L暴露組的IL-1β和LPS含量也有上升趨勢，但無統(tǒng)計學意義。

圖3 BDE-209暴露后斑馬魚腸道內(nèi)TNF-α、IL-1β和LPS含量變化Fig.3 Changes of TNF-α, IL-1β and LPS contents in the intestine of zebrafish after exposure to BDE-209

2.4 BDE-209對基因表達的影響

BDE-209對斑馬魚腸道內(nèi)屏障功能相關(guān)基因表達的影響如圖4(a)所示。結(jié)果表明，BDE-209暴露對斑馬魚腸道ZO-1 mRNA相對表達量無顯著影響。6 μg/L濃度暴露未顯著影響Claudin-2和Tjp2amRNA的表達，但顯著影響了Muc2.1 mRNA的表達。與對照組相比，60和600 μg/L濃度暴露后，腸道內(nèi)Claudin-2、Tjp2a和Muc2.1 mRNA相對表達量均發(fā)生了顯著地下調(diào)。

BDE-209對斑馬魚腸道內(nèi)炎癥通路相對基因表達量的影響如圖4(b)所示。觀察到經(jīng)60和600μg/L濃度的BDE-209暴露后，Akt2、Tlr-4、Nfkb2及IL-10 mRNA相對表達量均發(fā)生了上調(diào)。60 μg/L暴露組中，Nfkb2基因表達上調(diào)明顯，Akt2、Tlr-4和Nfkb2基因表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。600 μg/L暴露組顯著上調(diào)了Akt2、Nfkb2和IL-10基因的表達，但未顯著影響Tlr-4基因的表達。與60和600 μg/L暴露組不同的是，6 μg/L暴露組對炎癥通路相關(guān)基因的影響呈現(xiàn)不一致的現(xiàn)象，即上調(diào)了Nfkb2基因的表達，下調(diào)了Akt2、Tlr-4和IL-10基因的表達量，但與對照組相比均無統(tǒng)計學上的差異。

BDE-209對斑馬魚腸道內(nèi)細胞凋亡相對基因表達量的影響如圖4(c)所示。觀察到p53、Bax和Caspase3基因表達隨暴露濃度的增大呈單調(diào)上升趨勢，且與對照組相比，60和600 μg/L暴露濃度顯著上調(diào)了Bax和Caspase3基因的表達，600 μg/L暴露濃度還顯著上調(diào)了p53基因的表達。相反，Bcl2相對表達量則在BDE-209暴露后顯著下降，且3個暴露組均觀察到了與對照組相比的顯著差異。

圖4 BDE-209暴露后斑馬魚腸道內(nèi)屏障功能、炎癥通路和細胞凋亡相關(guān)基因表達量的變化Fig.4 Expression changes of genes related to barrier function, inflammatory pathway and apoptosis in the intestine of zebrafish after exposure to BDE-209

3 討論

BDE-209作為一種使用廣泛的溴代阻燃劑，在全球水生態(tài)系統(tǒng)中頻繁被檢出[27]。研究表明，BDE-209對許多動物都有毒性效應，包括大鼠、斑馬魚和蚯蚓[28-30]。然而，BDE-209對腸道的毒性效應鮮有報道。在魚類中，腸道是負責吸收營養(yǎng)物質(zhì)、離子和水的關(guān)鍵器官，同時也是阻止有害物質(zhì)進入的重要屏障[31]。大量研究表明，長期接觸化學污染物或重金屬會破壞腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)，導致腸道氧化損傷、炎癥反應和其他中毒相關(guān)癥狀[32-34]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)慢性BDE-209暴露會破壞斑馬魚腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)并造成氧化應激反應和炎癥反應，同時腸道屏障功能、炎癥通路和細胞凋亡相關(guān)基因的表達量也發(fā)生了顯著的變化。

3.1 BDE-209破壞腸道屏障功能

腸道形態(tài)越來越被認為是評價環(huán)境污染物影響的重要指標[35]。H & E染色后組織學觀察結(jié)果表明，BDE-209暴露28 d后，斑馬魚腸道的腸壁厚度變薄，腸壁外縱肌和腸絨毛內(nèi)部出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，600μg/L最高濃度暴露組還觀察到了腸壁和腸絨毛纖毛的嚴重破損，表明BDE-209暴露會改變斑馬魚腸道的結(jié)構(gòu)，從而破壞腸道的物理屏障和功能。

緊密連接蛋白，如跨膜蛋白Claudins以及胞質(zhì)蛋白ZO-1和TJP2是腸道物理屏障的重要組成部分[36]。緊密連接蛋白的異常表達水平可以影響腸道物理屏障的功能，調(diào)節(jié)腸道通透性的變化[37]。本研究發(fā)現(xiàn)BDE-209暴露后，斑馬魚腸道內(nèi)ZO-1、Claudin-2和Tjp2a的mRNA相對表達量降低。先前也有研究發(fā)現(xiàn)，通過將BDE-209溶解在玉米油中喂食小鼠28 d后，其腸道內(nèi)緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達量顯著下調(diào)，并提高了血清腸道通透性生物標志物的含量，導致腸道通透性增加，從而促進了糞便毒素從腸腔向全身循環(huán)的轉(zhuǎn)運[2]。Chen等[19]也發(fā)現(xiàn)對成年斑馬魚進行5 ng/L的BDE-71急性暴露后，其腸道內(nèi)Tjp2基因的表達量發(fā)生顯著下調(diào)，提示BDE-71會破壞腸道屏障的完整性。結(jié)合組織病理切片觀察結(jié)果，BDE-209暴露可能是通過下調(diào)緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達量，從而導致腸道物理屏障破壞，腸道通透性增加，其結(jié)果導致腸壁變薄和結(jié)構(gòu)破損。本研究還觀察到BDE-209暴露對Muc2.1基因表達的顯著下調(diào)作用。腸道黏膜通過分泌大量黏液和抗菌肽形成一道黏膜屏障用來將腸上皮與腸腔分開，以保護上皮細胞免受攝入的食物、病原菌和代謝產(chǎn)物造成的物理和化學損傷[38-39]。其黏液主要由黏蛋白Muc2組成。Muc2表達降低，導致腸道內(nèi)黏蛋白產(chǎn)生受抑制，造成了腸絨毛纖毛被破壞。這些結(jié)果表明，BDE-209可能通過降低黏蛋白和緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達，減少了黏液生成和降低了緊密連接蛋白的表達，從而造成對腸道結(jié)構(gòu)的破壞。這種現(xiàn)象可能會加劇BDE-209通過腸道屏障進入斑馬魚體內(nèi)，對宿主造成更嚴重的損害。

3.2 BDE-209引起腸道氧化損傷

越來越多的研究表明，環(huán)境污染物暴露會導致生物體內(nèi)ROS升高，進而誘導氧化應激、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)過氧化以及DNA氧化損傷[40-44]。研究表明，BDE-209存在時會引起動物和人體器官產(chǎn)生高水平的ROS，進而導致器官損傷[45,46]。本研究結(jié)果與先前研究一致地發(fā)現(xiàn)，BDE-209暴露后斑馬魚腸道內(nèi)ROS含量升高，表明長期暴露于BDE-209中可能導致腸道的氧化損傷。Rajput等[47]也報道了暴露于BDE-209會導致海豚成纖維細胞內(nèi)ROS含量升高，并可能通過氧化應激啟動細胞壞死和凋亡的初始過程。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，MDA含量升高被認為是自由基誘導的氧化應激的生物標志物[48]。本研究結(jié)果表明，各濃度BDE-209暴露均使斑馬魚腸道中MDA含量升高。SOD和CAT被認為是抵御氧化應激的第一道防線。具體而言，ROS的氧自由基通過SOD轉(zhuǎn)化為H2O2，H2O2進而被CAT降解為水和分子氧[49]。因此，作為氧化應激指標的ROS和MDA的累積會改變SOD和CAT的活性。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng) 28 d BDE-209暴露后，60和600μg/L暴露組中ROS、MDA、CAT和SOD的含量相較于對照組均明顯上升，說明為了應對氧化損傷效應，增加的SOD和CAT活性提供了一種適應性機制，通過清除產(chǎn)生的ROS來維持氧化還原動態(tài)平衡，從而保護機體免受氧化損傷。類似地，Meng等[50]也報道了暴露于BDE-47和BDE-153會導致成年斑馬魚肝臟中SOD和CAT含量上升以應對增加的ROS。但值得注意的是，600 μg/L暴露組的SOD含量較60 μg/L暴露組略有下降，而ROS含量在600μg/L暴露組中持續(xù)升高，推測這是由于高濃度組的斑馬魚難以抵抗BDE-209脅迫所產(chǎn)生的大量的ROS。以上結(jié)果表明BDE-209以濃度依賴的方式誘導斑馬魚的腸道氧化應激。

3.3 BDE-209引起腸道炎癥反應

炎癥反應與氧化應激之間有著密切的聯(lián)系。ROS的過度產(chǎn)生可以增加膜的通透性和細胞壓力，最終導致腸道屏障功能障礙、腸內(nèi)病原菌增多和炎癥的增加[51]。反過來，致病菌通過ROS和LPS引起腸道炎癥，從而進一步加重腸道的炎癥反應[52]。TNF-α和IL-1β是2種重要的促炎細胞因子，廣泛參與生物體內(nèi)的炎癥、凋亡、細胞增殖和免疫等相關(guān)過程，其表達水平被認為是魚類炎癥的有效生物標志物[49]。LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁的組成部分，可以激活各種炎癥細胞，并誘導炎癥細胞釋放炎癥介質(zhì)，進而引發(fā)炎癥反應[53]。本研究中，各濃度暴露組均顯著提升了促炎因子TNF-α的蛋白含量，且60和600 μg/L高濃度組暴露下還顯著提升了促炎因子IL-1β和內(nèi)毒素LPS的含量，表明BDE-209暴露濃度的升高加重了斑馬魚腸道內(nèi)的炎癥反應。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對細胞功能非常重要，主要參與炎癥反應、細胞凋亡和應激反應[54]。NF-κB信號通路的激活與一系列的促炎和細胞毒性細胞因子的生成有關(guān)，包括TNF-α、IL-1β 和IL-6。AKT 和TLR4均可激活NF-κB信號通路。先前研究表明，TLR4可通過激活MyD88，進而觸發(fā)NF-κB信號通路下游的激活和促炎細胞因子的合成[55]。NF-κB的激活需要IκB的磷酸化，AKT的激活可促進IκB的磷酸化進而激活NF-κB信號通路[56]。在本研究中，60和600μg/L暴露組顯著上調(diào)了Nfkb2的基因表達，表明高濃度BDE-209暴露可能會激活NF-κB。然而，與對照組相比，Akt2和Tlr-4 mRNA的相對表達量在6μg/L暴露組中略微下降，但在60和600 μg/L暴露組中上調(diào)，僅600 μg/L暴露組的Akt2相對表達量與對照組有顯著差異。因此，BDE-209對NF-κB激活的具體通路還有待進一步驗證。此外，600 μg/L暴露組中還觀察到IL-10表達量的顯著上調(diào)。IL-10是重要的抗炎細胞因子，可以抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生以抑制炎癥反應。其mRNA相對表達量上調(diào)可能是炎癥增加產(chǎn)生負反饋調(diào)節(jié)所導致的。

3.4 BDE-209誘導腸道細胞凋亡

大量證據(jù)表明，氧化應激所產(chǎn)生的大量ROS會通過改變導致基因毒性的凋亡相關(guān)蛋白來刺激細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導過程[57]。多數(shù)凋亡信號轉(zhuǎn)導過程與p53、Bax、Bcl2和Caspase家族等凋亡相關(guān)蛋白的表達變化有關(guān)。p53是一種腫瘤抑制因子，在細胞生長、分化、DNA修復和凋亡方面發(fā)揮著重要作用[58]。細胞應激誘導的ROS的產(chǎn)生可以調(diào)節(jié)p53的活性，其可通過包括體內(nèi)和體外的磷酸化和乙?；刃揎椷^程被激活并啟動細胞周期停滯或凋亡程序。本研究顯示，在BDE-209脅迫下，腸道內(nèi)p53基因表達隨暴露濃度升高而上調(diào)，且最高濃度組和對照組之間存在基因表達顯著差異，提示p53可能參與了BDE-209誘導的細胞凋亡。此外，p53還可通過上調(diào)促凋亡基因Bax的轉(zhuǎn)錄和下調(diào)抗凋亡基因Bcl2的轉(zhuǎn)錄來誘導細胞凋亡[59]。Bax和Bcl2都屬于Bcl2家族，但它們的功能完全不同。Bax可以通過線粒體凋亡途徑誘導細胞色素C釋放到胞漿中，導致Caspase激活并促進細胞凋亡，而Bcl2可以抑制細胞色素C從線粒體釋放[60]。以前的一些研究認為Bax/Bcl2比的降低與細胞死亡密切相關(guān)[61]。在本研究中，隨著BDE-209濃度的增加，Bax和Caspase3 mRNA相對表達量顯著上調(diào)，Bcl2 mRNA相對表達量顯著降低。因此，推測BDE-209可能是通過p53-Bax/Bcl2-Caspase3途徑誘導了斑馬魚腸道內(nèi)的細胞凋亡。

4 結(jié)論

(1) 高濃度BDE-209暴露造成腸道的腸壁變薄、腸絨毛內(nèi)空泡化加重以及腸壁和腸絨毛纖毛破損等嚴重的損傷，同時下調(diào)了腸道內(nèi)ZO-1、Claudin-2和Tjp2a的mRNA表達量來影響腸道的物理屏障功能。

(2) BDE-209暴露造成了腸道內(nèi)ROS和MDA含量升高，并增加CAT和SOD的含量來誘導氧化應激。

(3) BDE-209通過上調(diào)促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的含量和腸道內(nèi)LPS含量導致腸道的炎癥反應加重。

(4) BDE-209暴露上調(diào)了p53、Bax、Caspase3基因表達并下調(diào)了Bcl2基因表達，提示可能通過啟動p53-Bax/Bcl2-Caspase3途徑促進斑馬魚腸道內(nèi)的細胞凋亡。