HPLC分析煙草化學(xué)成分

王振峰(河南化工技師學(xué)院，河南 開封 475000)

1 HPLC介紹

高效液相色譜儀是一種在20世紀70年代發(fā)展起來的新型分離分析技術(shù)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和改進，它已經(jīng)成為應(yīng)用廣泛的化學(xué)成分分離分析的主要方法。高效液相色譜儀將液體作為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，通過分析樣品與固定相和流動相發(fā)生選擇作用，使物質(zhì)的各種成分進行分離。分離之后，再選擇相應(yīng)的檢測器進行成分的檢測，由此對樣品的成分進行分析和研究。相比較于傳統(tǒng)的分析方法，高效液相色譜分析的分析速度很快，通常分析一個樣品只需要30分鐘左右就能完成[2]。HPLC還可以選擇固定相和流動相以此來使自己的分離效果達到最佳標準，比起其他的分離技術(shù)更加高效節(jié)能。而且HPLC在測定過程中不受樣品揮發(fā)性和穩(wěn)定性的影響，多用它來測定一些其他方法無法測定的高分子化合物。同時物品經(jīng)過液相色譜儀測定過后，色譜柱不會被破壞，可以重復(fù)的使用，樣品也不會被破壞，能夠進行回收再使用。

2 多種成分的分離

2.1 樣品的預(yù)處理

對煙草的化學(xué)成分進行分析研究之前最重要的一步就是將煙草中的各類成分分離出來，而分離樣品的關(guān)鍵就是煙草樣品的預(yù)處理，這個步驟在整個過程中都是很重要的，它影響著后面測定的成功和失敗以及結(jié)果的準確性。樣品的處理一般包括樣品的收集和前期制作，色譜分析對于被測定的樣品的預(yù)處理要求很高，它是色譜分析發(fā)展領(lǐng)域中重要的一個環(huán)節(jié)。目前根據(jù)資料顯示適用于煙草的預(yù)處理方法主要有以下幾個方法。

最簡單的就是水蒸氣蒸餾法，這個方法操作簡單而且比較穩(wěn)定，它可以使煙草中的揮發(fā)性物質(zhì)在還沒有達到它們沸點的時候就被蒸餾出來，并且和其他不揮發(fā)性物質(zhì)完全分離。但是這個方法需要有機溶劑的量很大。目前常用的方法是溶劑萃取法，它的提取效率很高而且比較便宜。對于固體物質(zhì)的提取通常采用冷浸法或者索式提取法。液相微萃取是近年發(fā)展起來的一種色譜分析樣品處理方法，它相比較于溶劑萃取法，縮短了樣品的萃取時間，提高了效率和樣品的利用率。是一種操作簡單而且處理效果很好的樣品處理方法之一，目前的應(yīng)用范圍較廣。

2.2 多酚的測定分析

煙草中有很多的酚類化合物，這些物質(zhì)的存在與煙草的色澤和香氣息息相關(guān)。而且煙草里面的酚類化合物一般都不穩(wěn)定，容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。在這個過程中會生成有色的物質(zhì)，從而影響煙草的顏色。在點燃煙草的時候，這些物質(zhì)很容易揮發(fā)出來，分解后進入到煙氣中，從而影響煙氣的香味，讓煙草的香味增加。目前主要運用以下幾種方法對煙草中的多酚類物質(zhì)進行分析。科學(xué)家們利用酚類物質(zhì)還原性強的這特點，發(fā)明了容量法來進行多酚類物質(zhì)的分析。在實驗中采用多種氧化劑對樣品進行滴定處理，然后通過反應(yīng)判斷樣品中的多酚類物質(zhì)含量及組成。這個方法操作簡單，對設(shè)備等要求較低，但是煙草中還有很多其他具有還原性的物質(zhì)，會對測定的結(jié)果產(chǎn)生影響。所以無法對各種酚類物質(zhì)進行準確測定。

在1977年，一位科學(xué)家開始使用高效液相色譜儀(HPLC)進行煙草中酚類物質(zhì)的分析研究。首先他運用色譜柱然后采用了梯度洗脫，得到了19個化合物的色譜峰，之后用紫外光譜的方法鑒定出了其中的7個多酚類化合物。之后的Nisseror等人再次使用HPLC進行煙草中多酚類物質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)在20 cm×4.6 cm內(nèi)填入5 nm 的Nucleosil的C18色譜柱上，采用甲醇作為流動相進行梯度洗脫，在用紫外光進行測定的時候，可以對煙草中的酚類等物質(zhì)進行分析檢測[3]。HPLC法是將各種物質(zhì)分開進行測定，采用不同的洗脫系統(tǒng)進行化合物的分析，這樣的操作可以得到更加準確的結(jié)果，不會被其他的物質(zhì)干擾，但是因為它需要進行多次的進樣然后洗脫分析，操作比較復(fù)雜而且十分耗費時間。因此現(xiàn)在很多的科學(xué)家開始進行梯度洗脫這方面的研究，希望可以節(jié)約實驗的時間，提高效率。目前應(yīng)用高效液相色譜儀進行這類物質(zhì)的分析已經(jīng)開始取締其他的方法，因此我們也應(yīng)該大力發(fā)展這個技術(shù)。

2.3 糖類的測定分析

在煙草中糖類與煙草的品質(zhì)有很大的關(guān)系，煙草燃燒的時候它們可以產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)和一些香氣，降低煙草氣味的刺激性，產(chǎn)生令人感到愉悅的氣味。當(dāng)然含糖量太大也會導(dǎo)致煙草的味道變差，對燃燒產(chǎn)生不良的影響。其中果膠多糖是一種最為復(fù)雜的多糖，它主要由果膠酸和果膠酯酸組成，它是高等植物細胞壁和相鄰細胞緊密結(jié)合的一種多糖。目前測定這類物質(zhì)主要是有三種方法。其中經(jīng)典的方法就是重量法，主要的步驟就是將煙草樣品中的游離糖和色素等物質(zhì)通過方法去除，然后得到細胞壁，再利用溶劑萃取的方法將樣品中的不溶于溶劑的多糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘亩嗵牵賹⑦@些物質(zhì)進行沉淀處理，最后分離沉淀得到想要的多糖。比色法也是一種測定糖類的方法，它是利用酸類物質(zhì)將煙草樣品中的果膠多糖分解，再使用硫酸-咔唑顯色進行糖類的測定。這兩種方法都有一定的缺陷和不足，無法對果膠多糖的成分進行具體的分析。

目前色譜法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于果膠多糖含量的測定和其結(jié)構(gòu)分析，色譜法對比其他的方法而言，分離效率更高、可以多組同時進行分析和適用于樣品的大量分析。色譜分析法一般是將煙草樣品進行水解等預(yù)處理之后，再利用氣相色譜法和高效液相色譜法進行分析。因為糖類中的單糖在紫外區(qū)基本沒有吸收，直接進行液相色譜法的分析效果很差。使用在進行單糖的液相色譜法之前都會進行衍生化處理，目前的衍生處理一般分為柱前和柱后衍生化，應(yīng)用最廣泛的是柱前衍生化，因為它對于設(shè)備的要求比柱后衍生化要低很多。采用柱前衍生化對糖類進行高效液相色譜的分析和研究，準確率很高而且還可以同時測定多種單糖的含量，大大地提高了工作效率和質(zhì)量。

2.4 色素的測定分析

煙草作為一種綠色植物，與其他的植物一樣含有大量的綠色素，其中主要是葉綠素a、葉綠素b和β-胡羅卜素等。色素對于煙草品質(zhì)有著很大的影響，色素很低的話，煙草發(fā)育會受影響，最后使煙草的品質(zhì)大大降低。煙草中色素含量過高，煙草葉子過大的肥厚，會影響煙草后期的質(zhì)量。色素中的葉綠素是煙草生長期間發(fā)生光合作用的關(guān)鍵物質(zhì)，煙草成熟后，葉子逐漸變黃，葉綠素含量開始降低，使煙葉后面被制作成煙草后，降低了燃燒使氣味的刺激性，提高煙草的品質(zhì)。其中色素中的類胡羅卜素對于煙草的氣味和色澤也有重要的影響，它們在降解后會形成許多帶有香味的物質(zhì)。

前期的色素測定一般是使用分光光度法進行色素的測定，這個方法發(fā)展歷史悠久，有著成熟的測定方法，但是這個方法測定色素得到的結(jié)果比較粗糙，不夠精確?，F(xiàn)在大家都開始采用高效液相色譜法進行色素的測定和分析研究，先將煙草樣品使用溶劑萃取法進行預(yù)處理，在使用高效液相色譜進行分離分析，因為不同的色素在不同的波長紫外線下面具有不同的最大吸收值，因此可以分析出樣品中含有的不同的色素及其含量。采用高效液相色譜對色素進行分析研究，將樣品的光譜圖與標準的進行對比，可以精準的進行定量分析，方便之后的研究。

2.5 激素的測定分析

植物激素是植物生長過程中必不可少的一種物質(zhì)，它對于植物的生長和發(fā)育起著重要的作用，植物激素的分泌影響著煙草的生長和煙草質(zhì)量。植物激素中的赤霉素和生長素是最重要的兩種激素，也是含量較高的兩種激素。赤霉素可以加速植物細胞的伸長，提高植物體內(nèi)生長素的含量，促進細胞的分裂和擴大，是植物生長過程中必不可少的。植物生長素是一類具有分裂細胞的激素，它能使植物細胞壁變得松弛，從而使細胞進行增長，同時還調(diào)節(jié)RNA和蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。

植物激素的測定方法比較多，最常用的就是氣相色譜法和高效液相色譜法。赤霉素和生長素都是不可揮發(fā)的物質(zhì)，采用氣相色譜法的時候，還需要進行衍生化，這樣處理耗費很多時間而且準確性不夠高。而且因為赤霉素沒有多個共軛雙鍵，吸收比較差，檢測的靈敏度比較低。而且植物激素中還有很多其他的激素，部分激素的含量很少，傳統(tǒng)的檢測分析方法不能精確地將這些激素進行分離分析。而運用高效液相色譜法進行分析的時候，可以在梯度洗脫過程中將激素進行準確的分離，然后再進行各種激素的分析和檢測。采用這個方法可以大大的節(jié)約時間，提高工作的效率和準確性。

3 結(jié)語

煙草是目前世界上重要的經(jīng)濟作物，煙草的質(zhì)量決定了它的價格也關(guān)乎眾多吸煙人士的身體健康。分析和研究煙草的化學(xué)成分是一項不可或缺的工作，通過研究煙草的化學(xué)成分我們可以更好地控制煙草的生產(chǎn)和煙草的質(zhì)量。但是目前關(guān)于煙草化學(xué)成分的研究還處于基本的階段，本文主要簡述了通過高效液相色譜儀對煙草的化學(xué)成分進行分離分析。HPLC是一種新型的檢測復(fù)雜化合物的手段，與其他的檢測方法比較，可以更加精準地進行樣品的分析，而且它的效率更高。

運用HPLC檢測煙草中的糖類，可以顯著的提高檢測的靈敏度，希望隨著技術(shù)的進步以后在使用HPLC的同時結(jié)合其他的檢測器，這樣對于檢測結(jié)果可以更加準確。采用高效液相色譜儀對煙草中的多酚進行檢測，利用梯度洗脫，可以同時進行多種酚類物質(zhì)的檢測和分析，大大提高了工作的效率。測定煙草中的色素的時候，采用高效液相色譜法對煙葉加工的多個階段進行采樣分析，可以得出在煙葉生長和制成煙草后煙葉里面不同色素含量的區(qū)別，可以幫助我們更加了解煙草的生長和生產(chǎn)，對于提高煙草的品質(zhì)有著重要的作用。同時利用HPLC對煙草的激素進行測定，可以方便知道什么激素在什么含量對于煙草的生長最有利，這樣就方便以后對煙草的生長激素進行調(diào)節(jié)，提高煙草的質(zhì)量和品質(zhì)。通過這些化學(xué)物質(zhì)的測定和分析，對于煙草的種植、加工和防護有著重要的作用，也可以為其他的研究提供準確的數(shù)據(jù)知識。