間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌作用的研究進(jìn)展

王媞爾 史明霞

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，云南省血液病研究中心（昆明650032）

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一組來源于中胚層間充質(zhì)，具有自我更新能力、多向分化潛能特性的非造血成體干細(xì)胞，其普遍存在于外周血、骨髓、臍帶、臍血以及脂肪等組織中。在合適的條件下，MSCs 可在體內(nèi)或體外被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞等。

目前來說，MSCs 自身的低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)特性已被應(yīng)用于臨床干細(xì)胞移植治療，但是其免疫調(diào)節(jié)的可塑性等問題常導(dǎo)致MSCs的療效出現(xiàn)異質(zhì)性和不穩(wěn)定性。近年發(fā)現(xiàn)MSCs移植的方案在實(shí)驗(yàn)或臨床上不僅沒有達(dá)到可用于治療的水平，而且可能會出現(xiàn)異常分化、毒性、免疫反應(yīng)、栓塞形成和發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)［1］，這些因素均會導(dǎo)致MSCs 的應(yīng)用被限制。不少研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)體外培養(yǎng)后，MSCs的歸巢率也出現(xiàn)了明顯降低。有證據(jù)表明，移植的MSCs 在靶組織中實(shí)際能夠定位且存活的量極少，且它不是依靠分化機(jī)制而是以旁分泌的方式來發(fā)揮改善器官功能及調(diào)節(jié)治療的作用［2］。

MSCs 不但可以合成和分泌廣泛的可溶性因子（細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子），也可以分泌細(xì)胞外囊泡（EV）。前者對其周圍的細(xì)胞的確可以產(chǎn)生部分影響［3］，但無一能夠充分表現(xiàn)MSCs 的功效。而后者是從細(xì)胞膜上脫落或者由細(xì)胞分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，直徑從40 nm 到1 000 nm 不等，主要由微囊泡（microvesicles，MVs）和外泌體（exosomes，Exs）組成，它們一旦釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，可以通過旁分泌調(diào)節(jié)作用于附近的受體細(xì)胞，來介導(dǎo)對其他細(xì)胞的作用。MVs 是細(xì)胞在損傷、激活或凋亡后由細(xì)胞膜向外脫落釋放的小囊泡（直徑約為100 ～1 000 nm）；Exs 是首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞上清液中被發(fā)現(xiàn)的一種膜性囊泡（直徑30 ～150 nm），主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成多泡體，經(jīng)多泡體外膜與細(xì)胞膜融合后分泌到胞外，其攜帶有母細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、核酸以及脂質(zhì)等重要成分［4］。

目前大部分培育的哺乳細(xì)胞類型都可以分泌EVs，且廣泛存在于血液、唾液、腦脊液、尿液和乳汁等體液中。許多文獻(xiàn)記載，差速超速離心法是EVs 分離提取技術(shù)中最常用的方法。但為了保持提純率和特異性的穩(wěn)定，近年來多數(shù)研究者將此法聯(lián)合其他技術(shù)一并使用，例如密度梯度、過濾、沉淀、大小排斥層析和免疫分離法等；并且開發(fā)出其他技術(shù)或技術(shù)組合的多項(xiàng)互補(bǔ)法，其效果明顯優(yōu)于單一方法。在制備EVs 方面，盡可能完善對其來源的定量檢測，保證內(nèi)含物的豐富性、維持其特異性亦是必要的［5］。

人們逐漸發(fā)現(xiàn)EVs 與細(xì)胞療法明顯不同的是其相對穩(wěn)定和可存留，并在同種異體給藥后呈現(xiàn)出的免疫排斥率亦較低［2］。以往關(guān)于細(xì)胞間作用的多數(shù)研究主要關(guān)注在MSCs產(chǎn)生的可溶性因子方面，而目前了解到EVs 才是胞間通訊的真正的重要介質(zhì)［6］，且MSC-EVs 不僅具有母細(xì)胞的生物學(xué)活性，也能規(guī)避在MSCs 治療應(yīng)用中的弊端，成為潛在的治療方法或治療劑的運(yùn)送載體［7］。

1 在心肌修復(fù)中的研究

近年來，我國冠心病的發(fā)病率逐年升高，而心肌再灌注治療策略對于心肌梗死的患者尤顯重要。在冠狀動脈發(fā)生部分或急性阻塞后，予以再通治療，雖其目的是為了恢復(fù)心肌供血、減少損傷或持續(xù)壞死的心肌細(xì)胞，但在此過程中可能會通過激活某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而致心肌細(xì)胞死亡和功能惡化，發(fā)生心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischaemia/reperfusion，MI/R）［8］。然而，當(dāng)血管再通后，在缺血期引起的損傷卻更加凸顯，甚至?xí)l(fā)生嚴(yán)重的心律失常而致猝死，如在心內(nèi)直視手術(shù)、冠狀動脈搭橋術(shù)或腔內(nèi)成形術(shù)、溶栓術(shù)后以及心肌內(nèi)側(cè)支循環(huán)血量突然增加等情況下可能出現(xiàn)［9］。目前其發(fā)生機(jī)制尚未明確，但有研究表明可能與細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多［10］、鈣超載、炎癥反應(yīng)以及能量的代謝紊亂等因素的參與有關(guān)［11-12］?，F(xiàn)今尚無明確有效治療MI/R 的方法，人們將眼光聚焦于藥物和細(xì)胞治療的方向，但考慮藥物治療有時(shí)間依賴性，遂MSCs 治療MI/R 逐漸成為研究者應(yīng)用治療的新目標(biāo)。此外，在干細(xì)胞移植治療中，暫無很好辦法使MSCs 有效分化為心肌細(xì)胞，且移植中有很多副作用問題尚未明確，但Exs 修復(fù)損傷組織的能力卻逐漸被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)缺血再灌注后，MSC-EVs 可以通過傳遞miRNA或某種蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)能量的代謝平衡、避免鈣過載、激活促存活通路、抑制死亡受體通路以及改善缺血微環(huán)境來進(jìn)一步抑制細(xì)胞的凋亡。MAO 等［13］將轉(zhuǎn)染了KLF3-AS1 基因的hMSCs-Exs 注射至心肌梗死大鼠模型中，或用hMSC 條件培養(yǎng)液培養(yǎng)缺氧心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)hMSCs-Exs 中KLF3-AS1的過表達(dá)可以顯著減少心肌梗死面積，減少細(xì)胞凋亡，且Exs 抑制劑可以逆轉(zhuǎn)條件培養(yǎng)液中促進(jìn)細(xì)胞存活的功能。有觀點(diǎn)認(rèn)為MSCs-Exs 可以通過miR-182 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的狀態(tài)來減輕小鼠心肌I/R損傷［14］。此外，MSC-Exs 還可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的自噬，來減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心功能的改善［15］。

2 在呼吸系統(tǒng)中的研究

有研究發(fā)現(xiàn)MSCs 在減輕多種類型的肺損傷治療中是安全且可行的［16］。MSCs 效應(yīng)的重要作用是在損傷部位向特定細(xì)胞的分化，而不少研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)注射MSCs 的確可以改善損傷、減少破壞，但其在損傷部位的植入較少且存活短暫，分化程度也非常低，發(fā)揮保護(hù)機(jī)制的主要是其釋放的旁分泌因子［17］，且條件培養(yǎng)基可以同細(xì)胞一樣發(fā)揮促進(jìn)修復(fù)及分化的作用［18］。慢性阻塞性肺病易引起肺動脈高壓（PH），常致右心衰竭及死亡，當(dāng)今治療手段仍無法徹底逆轉(zhuǎn)病情的進(jìn)展并改善生存率。王英宏等［19］發(fā)現(xiàn)大鼠的MSC-EVs 能明顯減低自身的肺動脈壓及右心室壓力，緩解肺血管與右心室重構(gòu)，減輕組織纖維化的程度，對炎癥細(xì)胞發(fā)揮部分抑制作用。

近年支氣管哮喘的發(fā)病率增長與氣道反應(yīng)性增高相關(guān)。MSCs 和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）均是強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)劑，Tregs 的異常增殖和功能在哮喘的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，而MSCs 可通過其免疫調(diào)節(jié)特性改善多種免疫介導(dǎo)的疾病。在小鼠模型全身施用MSC-EVs 能夠通過miR-146a-5p抑制先天性淋巴樣細(xì)胞在哮喘疾病中的主導(dǎo)功能，從而減輕氣道高反應(yīng)性［20］。有學(xué)者通過分離出MSC-EVs，研究其對哮喘患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的免疫調(diào)節(jié)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 可上調(diào)PBMC 中IL-10 和轉(zhuǎn)化生長因子β-1 的表達(dá)，促進(jìn)Tregs 的增殖和免疫抑制能力，表明其在免疫調(diào)節(jié)中可發(fā)揮重要作用，且在治療哮喘疾病中具備巨大潛力［21］，是極有前途的無細(xì)胞治療劑。

3 在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用研究

MSCs 由于自身突出的免疫抑制潛能已經(jīng)在眾多領(lǐng)域中獲得了廣泛的研究。近年來，許多臨床前和臨床試驗(yàn)研究表明，MSCs 在體內(nèi)外的免疫抑制潛能可以改善許多免疫介導(dǎo)的疾病，如自身免疫性疾病，主要有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、急性移植物抗宿主病、自身免疫性肝炎、慢性腎臟病等，而支持MSCs 免疫調(diào)節(jié)作用的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制是產(chǎn)生旁分泌因子。

隨著研究的進(jìn)展，逐漸發(fā)現(xiàn)MSC-EVs 可能通過多種機(jī)制改善腎臟疾病模型中的腎臟損傷，包括急性腎損傷和慢性腎臟疾病，這些機(jī)制包括免疫調(diào)節(jié)和再生作用。例如，MSC-EVs 可通過降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平和減少細(xì)胞凋亡來改善腎臟缺血再灌注損傷［22］。在環(huán)孢菌素引起的慢性腎臟毒性的小鼠模型中，予以MSCs 條件培養(yǎng)液似乎也會呈現(xiàn)出同MSCs 一樣的優(yōu)勢效果，促進(jìn)部分腎功能恢復(fù)，減少細(xì)胞凋亡和組織纖維化，進(jìn)一步改善預(yù)后，表明MSCs 植入的細(xì)胞療法并非是必要的［23］。

目前異基因造血干細(xì)胞移植是難治性血液病可能唯一的治療方法，但易引起急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease，aGVHD）的發(fā)生，此時(shí)抑制aGVHD 的出現(xiàn)是移植成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。盡管皮質(zhì)類固醇激素是aGVHD治療的首要方案，但對類固醇激素耐藥的患者可高達(dá)50%，致最終治療效果欠佳［24］。后續(xù)發(fā)現(xiàn)MSCs可作為新的治療方法，但考慮到MSCs臨床應(yīng)用的安全性問題及其分泌機(jī)制等因素，許多研究者選擇使用MSC-EVs來進(jìn)行臨床前及臨床試驗(yàn)研究。LI 等［25］在小鼠體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，人臍血源性的MSCs-EVs 可通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來預(yù)防危及生命的aGVHD 的發(fā)生及降低其嚴(yán)重程度，顯著提高了存活率。KORDELAS等［26］通過使用MSC-EVs 治療aGVHD 患者后發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 可顯著緩解患者腹瀉、皮疹及感染等臨床不良反應(yīng)，從而減少類固醇用量，改善預(yù)后。

自身免疫性肝炎是一種難治型疾病，目前除類固醇激素外，暫未發(fā)現(xiàn)其他有效的醫(yī)治方法。FENG 等［27］發(fā)現(xiàn)可通過利用MSC-Exs 作為載體的特性，使其攜帶microRNA-223-3p 運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)來調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)、減輕肝損傷，為自身免疫性肝炎的治療提供一個(gè)新興的方向。

以上許多研究表明，MSC-EVs 的無細(xì)胞療法已然成為免疫調(diào)節(jié)和治療免疫介導(dǎo)性疾病的一種有潛在的安全療法。

4 其他疾病中的應(yīng)用研究

近年來，不少患者被神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛所困擾，且治療困難。SHIUE 等［28］發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSC）來源的外泌體可在大鼠神經(jīng)損傷所致的疼痛模型中發(fā)揮有效的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)功效，同時(shí)兼具抗炎及前神經(jīng)營養(yǎng)作用，也可將無細(xì)胞療法認(rèn)為是未來治療神經(jīng)損傷所致疼痛的新策略之一。XIE 等［29］在臍帶血-間充質(zhì)干細(xì)胞（CB-MSC）共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入MSC-MVs 后，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著提升臍血中CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增量，且原始祖細(xì)胞的增殖量也明顯高于MSCs 共培養(yǎng)系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)MSCs的造血支持作用上亦做出了貢獻(xiàn)。SHI等［30］在大鼠尿道損傷模型中局部應(yīng)用MSC-Exs 后證實(shí)其可減輕組織纖維化、促進(jìn)血管生成，可有效防止尿道狹窄的出現(xiàn)。

5 小結(jié)及展望

MSCs 的旁分泌作用（特別是MSC-EVs）雖然使得無細(xì)胞療法看似在治療多種疾病中很有潛力，但在臨床應(yīng)用上仍然存在巨大的挑戰(zhàn)，為了使其成為標(biāo)準(zhǔn)的診斷工具和更加優(yōu)化的治療方法，有待進(jìn)一步的研究。