間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體修復(fù)脊髓損傷作用機(jī)制的研究進(jìn)展

馬麟，張曉勃，趙光海，鞏朝陽，張海鴻

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，蘭州 730030

脊髓損傷（SCI）是一種破壞性神經(jīng)退行性疾病，臨床上目前缺乏對(duì)該病有效的治療方法，而納米技術(shù)和再生醫(yī)學(xué)策略為新型療法的開發(fā)帶來了希望。干細(xì)胞可通過替代丟失或受損的細(xì)胞為神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)支持，改善脊髓的微環(huán)境，從而促進(jìn)受損軸突再生，加快SCI修復(fù)［1］。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）可來自骨髓、脂肪、臍帶血和胎盤等多種組織，具有歸巢、增殖、分化、分泌和免疫調(diào)節(jié)的功能，是動(dòng)物研究和人類臨床試驗(yàn)中最常用的干細(xì)胞［2］。外泌體是釋放到細(xì)胞膜外的納米級(jí)囊泡，含有大量復(fù)雜分子如蛋白質(zhì)、脂類和各種核酸，而這些分子的特性與它們的來源細(xì)胞有關(guān)［3］。MSCs外泌體（MSCs-Exo）的生物學(xué)功能與MSCs相似，但MSCs-Exo更穩(wěn)定，不會(huì)引發(fā)機(jī)體免疫排斥反應(yīng)；其具有易分離的特點(diǎn)，故可用于將遺傳物質(zhì)或藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞；并且尺寸相對(duì)較小，故能滲透血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位［4-5］。因此，MSCs-Exo是無細(xì)胞治療的合適選擇。多項(xiàng)研究顯示，MSCs-Exo在SCI修復(fù)中有巨大潛力。本文就MSCs-Exo修復(fù)SCI的作用機(jī)制綜述如下。

1 MSCs-Exo通過促進(jìn)血管生成修復(fù)SCI

血管生成是SCI修復(fù)的關(guān)鍵，局部血管丟失與血腦屏障損傷引起的破壞可導(dǎo)致缺血和炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)脊髓神經(jīng)組織的綜合性損傷［6］。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，MSCs-Exo可以上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中與血管生成相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)；而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在MSCs-Exo介導(dǎo)的HUVECs增殖和遷移中起關(guān)鍵作用［7］。源自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的MSCs-Exo可直接被HUVECs吸收，激活VEGF、血管生成素和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）的表達(dá)，從而促進(jìn)HUVECs的遷移、增殖和血管形成［8］。SCI后的脊髓組織通常處于缺氧狀態(tài)，故低氧處理的MSCs-Exo與正常MSCs-Exo相比更易被HUVECs吸收，并可通過激活蛋白激酶A信號(hào)通路增加HUVECs中VEGF的表達(dá)［9］。

此外，MSCs-Exo可釋放內(nèi)源性miRNA來促進(jìn)血管生成并通過轉(zhuǎn)移外源性miRNA對(duì)HUVECs的靶基因進(jìn)行調(diào)控。人脂肪來源的MSCs-Exo富含miR-125a，HUVECs可通過攝取miR-125a來抑制血管生成抑制劑delta樣配體4（Dll-4）表達(dá)，并調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成［10］。HUANG等［11］研究顯示，MSCs-Exo可通過抑制miR-126直接靶向HUVECs中磷酸肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞基2和sprouty相關(guān)EVH1域蛋白1的表達(dá)發(fā)揮促血管生成作用。

2 MSCs-Exo通過促進(jìn)軸突生長(zhǎng)修復(fù)SCI

損傷軸突的再生和損傷部位軸突的生長(zhǎng)對(duì)SCI后脊髓功能的恢復(fù)具有重要意義，MSCs-Exo可通過誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和減少硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPG）的產(chǎn)生來緩解神經(jīng)傳導(dǎo)異常。ZHANG等［12］的體外研究顯示，用MSCs-Exo培養(yǎng)24 h和48 h的皮質(zhì)神經(jīng)元與對(duì)照組神經(jīng)元相比，遠(yuǎn)端軸突長(zhǎng)度分別增加了33%和24%，提示MSCs-Exo可在體外促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)。近期，有學(xué)者認(rèn)為抑制軸突再生的主要機(jī)制是CSPG的產(chǎn)生［13］。在尾靜脈注射MSCs-Exo的SCI大鼠中，CSPG在SCI區(qū)的沉積明顯減少，軸突損傷再生率比未經(jīng)治療的SCI大鼠高出80%。此外，攜帶介導(dǎo)軸突生長(zhǎng)特異性miRNA的MSCs-Exo可比不攜帶miRNA的MSCs-Exo更好地促進(jìn)軸突生長(zhǎng)［14］。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)絲蛋白200（NF200）、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（GAP-43）和神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）是參與神經(jīng)元再生的三個(gè)重要蛋白。在大鼠SCI模型中，尾靜脈注射miR-133b修飾的MSCs-Exo可增加GAP-43和神經(jīng)絲的表達(dá)，有助于軸突再生［15］。注射攜帶miR-29b的MSCs-Exo也可減輕SCI大鼠脊髓組織的病理學(xué)損傷，增加NF200、GAP-43和GFAP等表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元再生［16］。因此，MSCs-Exo可以作為一種新的生物活性物質(zhì)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，同時(shí)它也是miRNA和小干擾RNA的有效載體。

3 MSCs-Exo通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)修復(fù)SCI

臨床發(fā)現(xiàn)，SCI引起的神經(jīng)性疼痛通常難以治療。SHIUE等［17］使用MSCs-Exo作為無細(xì)胞療法治療大鼠神經(jīng)損傷所致的疼痛，發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo可抑制神經(jīng)結(jié)扎側(cè)L5、L6背根神經(jīng)節(jié)中TNF-α和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的表達(dá)，同時(shí)提高IL-10、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，提示其具有抗炎和增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的能力。SUN等［18］研究顯示，人臍帶來源的MSCs-Exo可有效觸發(fā)骨髓衍生的巨噬細(xì)胞（BMDM）從促炎表型（M1型）向抗炎表型（M2型）轉(zhuǎn)化。MSCs-Exo可通過下調(diào)炎癥細(xì)胞因子改善SCI后的功能恢復(fù)，并通過減輕損傷部位的炎癥來促進(jìn)脊髓損傷的愈合。因此，鞘內(nèi)注射MSCs-Exo可能是治療神經(jīng)損傷所致疼痛的一種有效方式。

SCI可激活經(jīng)典和替代補(bǔ)體途徑，這些途徑的激活可能加重炎癥過程和對(duì)脊髓的繼發(fā)性損傷。MSCs-Exo可作為互補(bǔ)抑制劑減少互補(bǔ)mRNA的表達(dá)，同時(shí)抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號(hào)通路并促進(jìn)SCI修復(fù)。SCI后補(bǔ)體表達(dá)增加，但在尾靜脈注射了MSCs-Exo的SCI大鼠血清中，補(bǔ)體C1q、C3、C4b、C6、C5及補(bǔ)體因子H（CFH）和補(bǔ)體因子P（CFP）的mRNA水平均低于未注射的SCI大鼠。這提示MSCs-Exo通過減少互補(bǔ)mRNA表達(dá)減輕SCI，用MSCs-Exo靶向關(guān)鍵補(bǔ)體可能是緩解SCI的有效方法［19］。SCI引起的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)受NF-κB通路調(diào)節(jié)，抑制NFκB途徑可有效減輕炎癥反應(yīng)并促進(jìn)SCI后的功能恢復(fù)，而補(bǔ)體C1q、C3與NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)［20］。此外，MSCs-Exo可以下調(diào)磷酸化型NF-κB（p-NFκB）和磷酸化型核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白α（p-IKBα）水平，并抑制SCI誘導(dǎo)的NF-κB亞基表達(dá)［19］。

4 MSCs-Exo通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)修復(fù)SCI

巨噬細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞具有高度可塑性，M1型、M2型巨噬細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞可同時(shí)存在于SCI部位，而M1與M2型的比例對(duì)SCI的修復(fù)非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs-Exo的治療作用與促進(jìn)巨噬細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞極化有關(guān)，其可通過外源性miRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞極化。SCI后誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要調(diào)節(jié)因子miR-124-3p可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至細(xì)胞核的信號(hào)傳導(dǎo)［21］。SCI時(shí)M2型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物低表達(dá)，外源性miR-124-3p可通過MSCs-Exo轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞，并通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞核的信號(hào)傳導(dǎo)來增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞的極化，從而減輕SCI［22］。此外，攜帶miR-216a-5p的MSCs-Exo能夠激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）信號(hào)通路，抑制Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號(hào)通路，從而將M1型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型［23］。MSCs-Exo還可攜帶具有神經(jīng)修復(fù)功能的lncRNA靶向細(xì)胞，lncRNAGm37494修飾的MSCs-Exo可通過抑制miR-130b-3p并促進(jìn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達(dá)來改變小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的M1、M2表型［24］。

5 MSCs-Exo通過抑制細(xì)胞凋亡修復(fù)SCI

SCI后繼發(fā)性的細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆改變，加重SCI造成的傷害，而MSCs-Exo能夠通過調(diào)節(jié)miRNA和凋亡相關(guān)蛋白減少細(xì)胞凋亡。MSCs-Exo治療后可顯著下調(diào)凋亡相關(guān)標(biāo)志物Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9水平［25］。此外，MSCs-Exo還可以通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白影響細(xì)胞凋亡。GU等［26］研究顯示，MSCs-Exo增加了SCI大鼠自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)，提示其可通過增加細(xì)胞凋亡自噬體激活細(xì)胞自噬，從而減少細(xì)胞凋亡。miR-21是SCI后顯著上調(diào)的miRNA，可下調(diào)抑癌基因PTEN、程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）和凋亡相關(guān)因子配體FasL表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡，對(duì)神經(jīng)起到保護(hù)作用。研究顯示，MSCs-Exo轉(zhuǎn)染miR-21可抑制PTEN及PDCD4表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡［27］。此外，miR-21-5p還具有抗凋亡作用，這種作用與促凋亡基因FasL表達(dá)水平降低有關(guān)［28］。

綜上所述，MSCs-Exo可通過促進(jìn)血管生成、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及抑制細(xì)胞凋亡修復(fù)SCI，其或可成為SCI修復(fù)的新希望。然而，在將MSCs-Exo用于臨床之前，MSCs-Exo的組織來源、分離、純化、擴(kuò)增及聯(lián)合應(yīng)用等問題亟待解決。由于MSCs-Exo單獨(dú)應(yīng)用的局限性，目前許多研究將MSCs-Exo與生物材料結(jié)合，例如水凝膠或以MSCs-Exo作為載體運(yùn)送基因藥物，而MSCs-Exo的聯(lián)合作用及靶向給藥機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。