血流感染的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)展

郭鷹 江代紅 郭富饒

重慶市巴南區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（重慶401320）

血流感染是由病原微生物侵入血液而導(dǎo)致的嚴(yán)重疾病，會(huì)造成血流障礙、器官衰竭甚至死亡，給社會(huì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)［1］。近年來，發(fā)病率持續(xù)增加，全世界每年大約有3 000 萬人罹患這一疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國，血流感染導(dǎo)致的死亡占醫(yī)院死亡總數(shù)的1/3～1/2 之多［2］。高病死率的主要原因就在于疾病發(fā)生早期不能進(jìn)行有效的抗生素治療，目前臨床采用的經(jīng)驗(yàn)性廣譜抗生素治療不僅會(huì)利于耐藥病原體的選擇和傳播，也會(huì)增加真菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還造成醫(yī)療資源的浪費(fèi)［3-5］。

血流感染快速、明確診斷，病原微生物識別及藥敏性分析是及時(shí)實(shí)行針對性抗生素治療的前提，對于改善患者預(yù)后尤為重要。血培養(yǎng)作為血流感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其作用及價(jià)值早已被證實(shí)。但耗時(shí)耗力，且陽性率較低，難以實(shí)現(xiàn)快速診斷［6］。進(jìn)入21 世紀(jì)后，分子生物學(xué)迅速發(fā)展，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，基于核酸的技術(shù)（DNA 分子雜交和快速PCR 檢測）等的出現(xiàn)徹底改變了傳統(tǒng)微生物鑒定方法，大大縮短了所需的時(shí)間［7］。隨著分子技術(shù)的不斷進(jìn)展，使得直接從血液樣本中鑒別微生物甚至分析其藥物敏感性成為可能。盡管用于血流感染的快速診斷新技術(shù)仍處于發(fā)展階段，其臨床應(yīng)用潛力不容小覷，可為血培養(yǎng)提供補(bǔ)充或替代選擇，在不久的將來或可完全替代傳統(tǒng)方法，從而更好地服務(wù)臨床。

本文分析了血培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，總結(jié)用于血流感染樣本的快速診斷技術(shù)最新進(jìn)展，討論這些技術(shù)的臨床應(yīng)用前景和面臨的挑戰(zhàn)，以期為提高和加快血流感染診斷和治療提供新的思路。

1 “金標(biāo)準(zhǔn)”血培養(yǎng)

血培養(yǎng)是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)。臨床上高度懷疑血流感染的發(fā)熱患者，需要通過血培養(yǎng)來進(jìn)一步識別致病微生物及其藥物敏感性，指導(dǎo)臨床治療。血培養(yǎng)一直被廣泛應(yīng)用，但整個(gè)過程耗時(shí)耗力，至少需要3～5 d 才能獲得結(jié)果［8］。連續(xù)監(jiān)測血液培養(yǎng)系統(tǒng)（CMBCS）的引入，使得大多數(shù)微生物，可在24 h 內(nèi)獲得陽性結(jié)果，加快了診斷進(jìn)程。但依據(jù)目前的培養(yǎng)流程，在培養(yǎng)陽性后仍需要48 h 才能獲得微生物鑒定（ID）及藥物敏感（AST）結(jié)果［9］。傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法耗時(shí)太多，顯然需要一種更好的方法，來實(shí)現(xiàn)快速診斷。

2 從陽性血培養(yǎng)物鑒定病原微生物的分子技術(shù)

目前的血培養(yǎng)方法需要將陽性培養(yǎng)物再次接種，過夜培養(yǎng)形成菌落克隆，再進(jìn)行ID 和AST 檢測。將陽性血培養(yǎng)物直接用來檢測可以較當(dāng)前方法提前12 ～24 h 獲得結(jié)果。

2.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）MALDI-TOF MS 是應(yīng)用在微生物鑒定中最廣泛的質(zhì)譜方法，具有方便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢。通過測定蛋白、核酸質(zhì)譜，與參考數(shù)據(jù)庫中的質(zhì)譜進(jìn)行比較來鑒定微生物。最初，這種方法僅應(yīng)用于培養(yǎng)基上的細(xì)菌菌落。但隨著研究的進(jìn)展，該技術(shù)已被用于直接從陽性血培養(yǎng)瓶中鑒定病原微生物，增加了它的實(shí)用性［10］。MALDI-TOF MS 被認(rèn)為是極具前景的快速診斷技術(shù)，對不同種類微生物的陽性預(yù)測值可以達(dá)到60% ～80%［11］?，F(xiàn)在已經(jīng)有比較成熟的商業(yè)試劑盒，如Sepsityper?kit（Bruker Daltonics）和VITEK?MS blood culture kit（bioMérieux）［12］。已有文獻(xiàn)報(bào)道基于MALDI-TOF MS 的自動(dòng)、同時(shí)多相基因檢測系統(tǒng)已被研發(fā)出來用于快速識別病原微生物及其耐藥基因。利用MALDI-TOF MS 快速鑒定病原微生物已經(jīng)被許多機(jī)構(gòu)整合為常規(guī)測試，然而，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)化的臨床前處理方法，檢測結(jié)果存在較大差異。另外，該方法不能適用于多重病原體感染的診斷［13］。

2.2 PCR 檢測技術(shù)微生物核酸被提取、純化和PCR 擴(kuò)增，隨后可通過高分辨率熔融曲線分析、微陣列雜交、凝膠電泳、序列分析或者實(shí)時(shí)定量PCR來快速診斷多種病原體感染［14］。另外，還可通過對16S 和（或）23S rRNA 的DNA 序列進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行焦磷酸測序以完成鑒定。研究表明，該方法與血培養(yǎng)結(jié)果的一致性達(dá)98.9%，敏感性為90.9%，特異性為99.6%［15］。在AST 檢測方面，PCR 技術(shù)被用于檢測甲氧西林、萬古霉素耐藥基因，對藥物使用、患者療效和成本效益具有積極的作用［16］?？偟膩碚f，基于PCR 的技術(shù)相對于傳統(tǒng)血培養(yǎng)的主要優(yōu)勢包括更快的周轉(zhuǎn)時(shí)間和在抗菌治療期間更高的檢出率［17］。但該技術(shù)也有著明顯的缺陷，PCR 技術(shù)檢測微生物種類有限。并且，這項(xiàng)技術(shù)成本較高，需要專業(yè)人員進(jìn)行操作［18］。

2.3 肽核酸熒光原位雜交技術(shù)（PNA-FISH）PNA熒光原位雜交技術(shù)是一項(xiàng)最新的分子診斷技術(shù)，只需要1.5～3 h就可以從陽性血培養(yǎng)物中檢測鑒定病原微生物［19］。PNA探針具有肽鏈骨架，與DNA 分子結(jié)合后，可以通過堿基互補(bǔ)配對原則高度特異地與細(xì)菌16S rRNA 及酵母18S rRNA 雜交。通過設(shè)計(jì)特殊的探針，包括葡萄球菌探針、腸球菌探針、革蘭陰性菌探針、酵母探針等，可以快速識別血流感染患者陽性血樣中的革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和假絲酵母菌。在一項(xiàng)研究中［20］，作者用PNA熒光原位雜交技術(shù)快速鑒別光滑念珠菌（Cgl）和白色念珠菌（Cal），及時(shí)調(diào)整治療方案，減少了不必要的棘球白素的使用。這一技術(shù)對于細(xì)菌和真菌都具有高度的特異性和敏感性，且快速、簡單，易于整合到當(dāng)前的診斷流程中，極具臨床應(yīng)用前景。當(dāng)然，該技術(shù)還需要進(jìn)一步研究以解決其技術(shù)缺陷，包括檢出限不低于105CFU/mL、探針數(shù)量極其有限且目前不具備檢測耐藥基因的能力。

2.4 單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)拉曼光譜可在單細(xì)胞水平上對單核細(xì)胞和真核細(xì)胞進(jìn)行拉曼光譜的檢測，生成其唯一的生物分子“指紋光譜”，用來識別病原微生物。拉曼光譜具有快速、靈敏、無標(biāo)記、無創(chuàng)、受水干擾小等特點(diǎn)，在多種病原微生物感染的診斷中也有著獨(dú)特優(yōu)勢，并且拉曼光譜技術(shù)可用于識別耐藥細(xì)菌。

中科院蘇州醫(yī)工所聯(lián)合團(tuán)隊(duì)基于Raman-DIP原理，開發(fā)了一種快速藥敏方法，可在21 h 內(nèi)給出血樣的藥敏結(jié)果［21］。血培養(yǎng)陽性的樣本加入到藥敏板作用后再加入重水，易感菌代謝活動(dòng)被抑制，拉曼圖譜呈現(xiàn)C-H 峰，而耐藥菌出現(xiàn)偏移的C-D峰。這種藥敏分析是基于抗生素對細(xì)菌作用的表型，因此結(jié)果不會(huì)因未知的耐藥機(jī)制或基因表達(dá)調(diào)控而產(chǎn)生對藥敏的誤判。

3 直接從血液中鑒定病原微生物的分子技術(shù)

治療血流感染的關(guān)鍵就在于早期抗生素的使用，臨床診斷后3 h 內(nèi)開始治療，可以顯著降低患者病死率［22］。然而，研究表明，早期不合理的抗生素治療會(huì)縮短患者的生存期［23］。因此，在疾病發(fā)生最初1～3 h 內(nèi)快速完成實(shí)驗(yàn)室診斷十分必要。傳統(tǒng)血培養(yǎng)鑒定受到培養(yǎng)陽性報(bào)警時(shí)間的限制，而直接從血液樣本中快速檢測則更具吸引力，可以將診斷時(shí)間縮短至數(shù)小時(shí)甚至數(shù)分鐘內(nèi)。

3.1 PCR-電噴霧電離質(zhì)譜（PCR/ESI MS）PCR技術(shù)和ESI MS 技術(shù)結(jié)合可以用來直接識別血液樣本中的病原微生物，完美結(jié)合了PCR 的高靈敏度和質(zhì)譜的高準(zhǔn)確度。運(yùn)用該技術(shù)的IRIDICA 平臺已經(jīng)被開發(fā)商業(yè)化，可以在6 h 內(nèi)，鑒定出常見的780 種細(xì)菌和念珠菌，但能識別的耐藥基因只有四種（mecA、vanA、vanB 和blaKPC）［14，24］。首先從5 mL 全血樣本中自動(dòng)提取DNA，加入不同引物，通過PCR 分別擴(kuò)增細(xì)菌和念珠菌的rRNA 基因，ESI MS技術(shù)測得擴(kuò)增產(chǎn)物分子量，與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比來鑒定微生物。這些引物和反應(yīng)成分經(jīng)過優(yōu)化以減少人類DNA的干擾，提高擴(kuò)增效率。METZGAR等［25］發(fā)現(xiàn)，PCR/ESI MS 與傳統(tǒng)血培養(yǎng)的一致性達(dá)80%，并在46 例血培養(yǎng)陰性樣本中檢測到了病原微生物，有著更高的靈敏度。不過，該技術(shù)檢測耐藥基因的能力有限，還需要常規(guī)血培養(yǎng)后再進(jìn)行AST。目前或可作為傳統(tǒng)方法的補(bǔ)充手段，但不能完全替代。

3.2 液滴數(shù)字檢測技術(shù)一種被稱為“集成綜合液滴數(shù)字檢測”（IC 3D）的新興技術(shù)聲稱可以在1～4 h 內(nèi)直接從少量全血中選擇性地檢測單個(gè)細(xì)菌，不需要培養(yǎng)增殖，也不需要基因擴(kuò)增。IC 3D將基于DNA 酶的傳感器與實(shí)時(shí)液滴微膠囊和粒子計(jì)數(shù)器結(jié)合。首先，直接將血液樣本分成數(shù)十億含細(xì)菌及DNA 傳感器的微米級液滴。傳感器與細(xì)菌靶序列結(jié)合后產(chǎn)生熒光信號，達(dá)到識別鑒定細(xì)菌的目的。液滴技術(shù)可以很大程度地減少血樣中其他物質(zhì)的干擾，避免了分離純化等繁瑣步驟。在一項(xiàng)研究［26］中，作者用該技術(shù)檢測大腸桿菌污染的血樣，對于每毫升僅含一個(gè)細(xì)菌的樣本，用時(shí)3.5 h，陽性率77%。該技術(shù)真正實(shí)現(xiàn)了簡單、快速、單細(xì)胞靈敏度，不過目前該系統(tǒng)每次只能檢測特定單一菌種，并且受限于熒光通道數(shù)量，可拓展能力差。

3.3 T2 磁共振T2 磁共振是一種小型化、基于磁共振的診斷技術(shù)，可在磁場存在時(shí)測量水質(zhì)子T2弛豫信號變化。該方法包括PCR 擴(kuò)增病原微生物特異性DNA 序列，然后將產(chǎn)物與超順磁納米粒子修飾探針雜交。雜交會(huì)導(dǎo)致納米顆粒聚集，出現(xiàn)可檢測到的變化，從而確定微生物的存在。T2 磁共振可以在不到5 h 內(nèi)檢測出復(fù)雜樣本中含量極少的目標(biāo)核酸［27］。科學(xué)家用T2 磁共振檢測五種常見病原微生物（ESKAPE，E.faecium、S.aureus、K.peneumoniae、A.baumanii、P.aeruginosa、ENT），并與傳統(tǒng)的血培養(yǎng)方法進(jìn)行了比較。該技術(shù)的敏感性和特異性均為90%，血培養(yǎng)陰性而磁共振陽性的樣本占10%。平均花費(fèi)時(shí)間為3.6～7.7 h［28］。不過，該方法不能提供微生物的耐藥信息，且費(fèi)用昂貴。未來的研究需要評估這些局限性是否可以克服，并進(jìn)一步驗(yàn)證這種方法在其他種類病原微生物檢測中的應(yīng)用。

3.4 微流控技術(shù)血液中病原微生物的濃度遠(yuǎn)低于紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等，有效分離是診斷的關(guān)鍵步驟。在一項(xiàng)研究中，作者用集成的微流控芯片技術(shù)快速分離血液中的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。該技術(shù)包括一個(gè)膜過濾模塊、細(xì)菌捕獲模塊和PCR 擴(kuò)增模塊。通過膜過濾分離血漿，再用甘露糖結(jié)合凝集素修飾的磁珠捕獲細(xì)菌，最后實(shí)時(shí)熒光定量PCR 識別細(xì)菌。濾過膜可以去除所有的白細(xì)胞和99.5%的紅細(xì)胞，細(xì)菌捕獲率接近85%，PCR 檢出限為每個(gè)反應(yīng)5 CFU，整個(gè)過程只需4 h［29］。與血培養(yǎng)方法相比，該技術(shù)可以在更短的時(shí)間內(nèi)檢測出血液樣本中低濃度的病原微生物，更大程度地發(fā)揮PCR 技術(shù)的優(yōu)勢［30］。當(dāng)然，該技術(shù)還需要進(jìn)一步的臨床研究來證明其價(jià)值。

另外，微流控技術(shù)也可以與生物芯片技術(shù)結(jié)合，將微生物的收集、培養(yǎng)、擴(kuò)增以及識別鑒定在復(fù)雜體系內(nèi)一步完成。生物芯片技術(shù)是將生物大分子固定于固相介質(zhì)上形成分子點(diǎn)陣，樣品與探針分子發(fā)生相互作用后信號被采集分析。生物芯片可以分為基因芯片和蛋白質(zhì)芯片，具有高通量、微型化和平行分析的特點(diǎn)，在微生物鑒定及耐藥基因分析中發(fā)揮越來越重要的作用。

4 結(jié)論

血流感染診斷的理想標(biāo)準(zhǔn)是3 h 內(nèi)快速識別細(xì)菌、真菌、病毒等微生物及其藥敏性，以便及時(shí)選擇有效的抗生素進(jìn)行治療，改善患者預(yù)后。分子技術(shù)的發(fā)展，使得快速診斷更趨向于理想標(biāo)準(zhǔn)。不過，每種技術(shù)都有其獨(dú)特的優(yōu)勢和缺陷。這就需要不同技術(shù)聯(lián)合使用以及不同領(lǐng)域之間的協(xié)調(diào)合作，科學(xué)家研究開發(fā)新的技術(shù)，臨床醫(yī)生綜合考量臨床指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)［31］，實(shí)驗(yàn)室工作人員掌握并積極使用新的檢測方法，工程師制造自動(dòng)化檢測設(shè)備，行業(yè)內(nèi)制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)流程。總之，各種新興分子技術(shù)有足夠潛力實(shí)現(xiàn)血流感染的快速診斷，但目前仍需作為血培養(yǎng)的輔助手段，不斷在臨床上進(jìn)行驗(yàn)證以獲取更多的數(shù)據(jù)，為日后替代傳統(tǒng)方法提供依據(jù)。