骨關(guān)節(jié)炎不同表型動(dòng)物模型的選擇與制作

孫潔，姜萍，陳宗銳

1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250014；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種與遺傳、創(chuàng)傷、代謝、應(yīng)力改變、炎癥等多因素相關(guān)的關(guān)節(jié)退行性疾病，好發(fā)于中老年人，以關(guān)節(jié)軟骨退變、骨質(zhì)增生為病理特征，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬、活動(dòng)受限等，最終可致關(guān)節(jié)功能障礙和殘疾。隨著人口老齡化和肥胖患病率的增加，髖和膝關(guān)節(jié)OA成為全球第11大致殘?jiān)颍?］，造成沉重的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)負(fù)擔(dān)。目前OA的治療僅限于對(duì)癥，尚缺延緩病情進(jìn)展的藥物，其病理機(jī)制及治療靶點(diǎn)、藥物亟待研究。新近研究表明，OA并非是單純的一種疾病，而是存在著不同表型，表型間存在的差異顯著影響預(yù)防及治療的精準(zhǔn)性。而OA的慢病性質(zhì)及人類(lèi)受試者的個(gè)體差異性體現(xiàn)了以人為對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的局限性，因此要深入研究不同表型OA具體病理機(jī)制及有效藥物治療方法，需要依據(jù)不同表型特點(diǎn)建立合理、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。我們查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前用于OA研究的動(dòng)物模型多種多樣，但缺乏對(duì)于不同表型動(dòng)物模型的歸納總結(jié)、比較分析。本文參考2011年柳葉刀OA分型［2］，對(duì)創(chuàng)傷性、代謝性、衰老性、遺傳性、疼痛性5種表型OA的動(dòng)物選擇與造模方法利弊進(jìn)行分析，為OA分型造模的研究提供參考。

1 動(dòng)物的選擇

動(dòng)物模型應(yīng)優(yōu)先選擇機(jī)能、代謝、結(jié)構(gòu)、疾病特點(diǎn)與人類(lèi)相似的動(dòng)物，同時(shí)考慮動(dòng)物護(hù)理、成本、可操作性、疾病進(jìn)展和對(duì)特定治療的反應(yīng)［3］。

1.1 小型動(dòng)物 小型動(dòng)物多用于研究OA發(fā)病機(jī)制和病理過(guò)程，具有更易獲取、成本更低、研究周期更短的優(yōu)勢(shì)。由于某些藥物在小動(dòng)物模型與人體實(shí)驗(yàn)中的效果并不完全相同，小型動(dòng)物常作為OA治療干預(yù)的第一個(gè)篩選模型。

1.1.1 小鼠 基因組測(cè)序顯示，平均85%的蛋白質(zhì)編碼基因在人類(lèi)和小鼠高度一致［4］，故基因調(diào)控誘導(dǎo)的遺傳性O(shè)A表型研究多選用小鼠造模，可對(duì)其進(jìn)行基因修飾或培育對(duì)OA敏感的品系。小鼠多用于OA分子水平研究，例如促炎細(xì)胞因子對(duì)OA發(fā)展的影響［5］。完成實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間長(zhǎng)短取決于動(dòng)物的骨骼成熟程度，小鼠骨骼成熟周期較短，約為10周［6］，適于短期實(shí)驗(yàn)。膝關(guān)節(jié)在生物力學(xué)和解剖結(jié)構(gòu)上與人類(lèi)有一定相似性，多用于膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）研究，但其關(guān)節(jié)腔較小，平均軟骨厚度至少比人類(lèi)小70倍［7］，手術(shù)操作及指標(biāo)取樣檢測(cè)存在難度，因此多用于塑造非手術(shù)誘導(dǎo)的OA模型。

1.1.2 大鼠 大鼠關(guān)節(jié)腔更大、軟骨及骨層更厚，手術(shù)、灌胃及關(guān)節(jié)內(nèi)操作較簡(jiǎn)便，可誘導(dǎo)部分甚至全層軟骨缺損的KOA模型，多用于基因治療、干細(xì)胞移植、人工軟骨植入和局部生長(zhǎng)因子治療研究［8］，因其反應(yīng)靈敏，還可用于疼痛觀察及藥物反應(yīng)、KOA與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)性研究［9］。

1.1.3 豚鼠 豚鼠與人類(lèi)OA的組織病理學(xué)相似度非常高，具有類(lèi)似的評(píng)分體系，且關(guān)節(jié)內(nèi)生物標(biāo)志物軟骨寡聚基質(zhì)蛋白、硫酸角質(zhì)素易于檢測(cè)［10］，適用于預(yù)防性治療的研究。另外，豚鼠存在自發(fā)性O(shè)A，對(duì)研究衰老型OA有一定價(jià)值。

1.2 中大型動(dòng)物 中大型動(dòng)物如兔、犬、豬等，其解剖結(jié)構(gòu)與人類(lèi)相似，有些動(dòng)物存在自發(fā)性O(shè)A，但實(shí)驗(yàn)成本較高、周期較長(zhǎng)，多用于臨床前實(shí)驗(yàn)確認(rèn)藥物療效［7］。

1.2.1 兔 兔的體型較大，易于標(biāo)本提取及指標(biāo)觀察，尤其適于早期OA研究，軟骨未發(fā)生缺損情況下即可評(píng)估早期OA［11］。兔關(guān)節(jié)腔較大，利于手術(shù)操作，采用前交叉韌帶切斷法（ACLT）構(gòu)建的兔OA模型Mankin評(píng)分分值較高，是研究OA軟骨退變較為理想的模型［12］。但由于兔具有很強(qiáng)的自愈能力，在模擬OA發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程方面存在一定局限性，且膝關(guān)節(jié)長(zhǎng)期屈曲，在步態(tài)及生物力學(xué)方面與人類(lèi)存在差異，關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)和分布也與人類(lèi)不同，不適合功能性研究。

1.2.2 犬 犬的膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與人類(lèi)相似，OA病因、癥狀與治療方法亦與人類(lèi)相似性較高，特別是胃腸道結(jié)構(gòu)及生理機(jī)能與人類(lèi)相似，尤其適合OA腸內(nèi)療法的研究［13］。犬的關(guān)節(jié)腔更大，利于手術(shù)操作及組織樣本提取，可應(yīng)用關(guān)節(jié)鏡及MRI檢查。但犬作為寵物，用于實(shí)驗(yàn)研究仍存在爭(zhēng)議，不易通過(guò)倫理審查。

1.2.3 羊、豬、馬 羊的半月板較大，且OA半月板損傷情況與人類(lèi)接近，適于OA半月板退變的研究，是ACLT法誘導(dǎo)OA的最佳動(dòng)物模型［14］，多用于臨床前實(shí)驗(yàn)。其中山羊膝關(guān)節(jié)的解剖結(jié)構(gòu)最接近人類(lèi)，軟骨層更厚，適合軟骨修復(fù)的相關(guān)研究。需要注意的是，反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)的特殊性可能對(duì)藥物實(shí)驗(yàn)存在影響。豬軟骨層較厚，適于軟骨觀察研究，馬的掌指關(guān)節(jié)與人膝關(guān)節(jié)有許多相似之處［7］，但二者成本過(guò)高，較少用于OA造模。

2 不同表型OA造模方法

2.1 創(chuàng)傷性O(shè)A表型造模方法 創(chuàng)傷性O(shè)A主要與機(jī)械應(yīng)力相關(guān)，可通過(guò)侵入性或非侵入性方式快速誘發(fā)。

2.1.1 侵入性誘導(dǎo)法 通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)侵入性操作迅速誘導(dǎo)OA，但需注意有創(chuàng)操作帶來(lái)的額外損傷及可能的感染所引起的混淆效應(yīng)。

ACLT具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)破壞小的優(yōu)勢(shì)，是目前最常用的手術(shù)造模方法。由于ACLT主要通過(guò)打破關(guān)節(jié)穩(wěn)定性誘導(dǎo)軟骨退變，相較半月板切除（MMT）術(shù)誘導(dǎo)的OA病變進(jìn)程更緩慢，故在藥學(xué)研究中的易用性更佳。劉振龍等［15］對(duì)兔行ACLT并剪斷2 mm以防愈合，4周后組織學(xué)評(píng)分判斷軟骨損傷處于早期，并指出MANKIN評(píng)分與OOCHAS評(píng)分均可用于OA評(píng)價(jià)，而后者可能更適于評(píng)價(jià)早期OA軟骨損傷。此外，低幅高頻振動(dòng)及患肢負(fù)重鍛煉均可加速ACLT誘導(dǎo)的大鼠OA進(jìn)程、縮短實(shí)驗(yàn)周期［16-17］。

MMT誘導(dǎo)的OA進(jìn)程較ACLT快，故適于短期研究，大鼠和豚鼠是MMT最常用的動(dòng)物。張榮凱等［18］切除大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶造模，4周內(nèi)改變類(lèi)似人類(lèi)早期OA，是研究早期OA的理想模型。

改良Hulth法是在傳統(tǒng)Hulth法基礎(chǔ)上保留后交叉韌帶或內(nèi)側(cè)副韌帶及后交叉韌帶的手術(shù)造模方法，造模成功率高，是目前常用的造模方法，適于中早期OA研究［19］。方銳等［20］在改良Hulth法基礎(chǔ)上強(qiáng)迫兔運(yùn)動(dòng)，觀察到軟骨退變?cè)缙诖鷥斝栽錾潦Т鷥敽筌浌羌?xì)胞和基質(zhì)減少、軟骨變軟到剝脫缺失的全過(guò)程，與單一改良Hulth法比較，大大縮短了造模周期。

閉合關(guān)節(jié)刻痕法創(chuàng)傷較小、炎癥輕微，被認(rèn)為是觀察早期OA變化，研究軟骨保護(hù)及修復(fù)治療較為理想的模型。李釗等［21］使用小針刀在股骨髁軟骨面、臏軟骨及脛骨平臺(tái)上閉合刻痕，不傷及半月板，術(shù)后強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)，5周后得到較為理想的OA模型。

2.1.2 非侵入性誘導(dǎo)法 通過(guò)體外沖擊誘導(dǎo)關(guān)節(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)損傷，可避免侵入性操作伴隨的感染及并發(fā)癥，減少誤差對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

關(guān)節(jié)內(nèi)脛骨平臺(tái)骨折法由壓頭提供沖擊力致關(guān)節(jié)閉合骨折，可調(diào)整力度控制病變嚴(yán)重程度，適用于研究急性損傷或骨折后早期OA，不適于研究慢性或低能量沖擊損傷OA［22］。

循環(huán)關(guān)節(jié)軟骨脛骨壓縮法通過(guò)向后膝關(guān)節(jié)施加軸向負(fù)荷使脛骨相對(duì)于股骨向前位移，是研究慢性過(guò)度使用損傷對(duì)OA影響的首選模型［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，使用此法造模5 d后6 N負(fù)荷誘導(dǎo)輕度滑膜炎，9 N負(fù)荷致前交叉韌帶撕裂、重度滑膜炎及異位軟骨形成［23］，一段時(shí)間的重復(fù)壓縮后可用于研究軟骨下骨變化［24］。

脛骨壓縮超載法采用單一機(jī)械循環(huán)加壓誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)損傷，適用于高能量沖擊創(chuàng)傷及早期OA研究。CHRISTIANSEN等［25］使用此法造模，發(fā)現(xiàn)1周內(nèi)骨小梁迅速大量丟失，第4周時(shí)快速恢復(fù)、關(guān)節(jié)間隙變窄，8周后顯示為輕度OA。

2.2 代謝性O(shè)A表型造模方法 代謝性O(shè)A主要與機(jī)械應(yīng)力、脂肪因子、高血糖、雌激素、孕酮失衡相關(guān)［2］，以飲食誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型及卵巢切除法為主，可用于肥胖、糖尿病、雌激素失衡相關(guān)OA研究。

高脂飲食誘導(dǎo)模型不破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整性及穩(wěn)定性，接近人類(lèi)肥胖型OA發(fā)病機(jī)制，在肥胖相關(guān)OA中最為常用。BARBOZA等［26］發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)雄性C57BL/6J小鼠發(fā)病的時(shí)間進(jìn)程約為20周，導(dǎo)致了明顯的肥胖、葡萄糖耐受不良及包括骨贅和軟骨潮汐復(fù)制在內(nèi)的早期OA。考慮到四足嚙齒類(lèi)動(dòng)物與人類(lèi)運(yùn)動(dòng)方式不同所致的負(fù)荷差異，SON等［27］在高脂飲食誘導(dǎo)基礎(chǔ)上使用跑步機(jī)訓(xùn)練小鼠兩足行走，建立了更接近肥胖型人類(lèi)關(guān)節(jié)負(fù)荷的OA模型。

卵巢切除法通過(guò)影響雌激素及其類(lèi)似物生成來(lái)誘發(fā)OA，適用于絕經(jīng)、骨質(zhì)疏松相關(guān)的OA研究。H?EGH-ANDERSEN等［28］通過(guò)切除卵巢誘導(dǎo)SD大鼠OA，發(fā)現(xiàn)代表骨吸收的CTX-Ⅰ及軟骨變化的CTX-Ⅱ水平與關(guān)節(jié)最終退變呈顯著相關(guān)性。王文勝等［29］在切除雙側(cè)卵巢基礎(chǔ)上對(duì)大鼠進(jìn)行上坡疲勞性跑臺(tái)訓(xùn)練，4周后軟骨Mankin評(píng)分達(dá)到損傷標(biāo)準(zhǔn)，較單純卵巢切除造模法的效率顯著提高。

2.3 衰老性O(shè)A表型造模方法 衰老性O(shè)A與年齡、軟骨細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)，目前以自然衰老的自發(fā)性O(shè)A或敲除抗衰老基因配合手術(shù)造模為主。其中具有自發(fā)性O(shè)A的Hartley豚鼠因組織病理學(xué)改變與人類(lèi)相似度高且生物標(biāo)志物易于檢測(cè)而較為常用［30］。于斐等［31］通過(guò)敲除抗衰老基因沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT1）配合單膝關(guān)節(jié)ACLT+MMT建立高齡小鼠KOA模型，模擬老年OA，可用于研究年齡相關(guān)OA及藥物長(zhǎng)期治療的有效性。

2.4 遺傳性O(shè)A表型造模方法 遺傳性O(shè)A主要與基因相關(guān)。曹斌等［32］篩選總結(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Col11a1、Col2a1基因，或Del1、Ⅱ型、Ⅸ型膠原基因突變，或軟骨基質(zhì)基因缺陷，均可誘發(fā)OA。此外，銅轉(zhuǎn)運(yùn)基因缺陷、MMP-13基因過(guò)表達(dá)、組織特異性BMP-1a型受體缺乏，以及ADAM-15基因、MMP-14基因、IL-6基因、Mig-6基因、A-1整合素基因、纖維調(diào)節(jié)素和基膜聚糖基因雙鏈、纖維調(diào)節(jié)素和二聚糖基因單鏈或雙鏈的敲除亦可導(dǎo)致OA［33］，可用于遺傳性O(shè)A發(fā)病機(jī)制及藥物療效研究。

2.5 疼痛性O(shè)A表型造模方法 疼痛性O(shè)A主要與炎癥、骨破壞及異常疼痛相關(guān)［2］，可采用關(guān)節(jié)腔注射法、寒冷刺激法及血液循環(huán)阻斷法造模。

關(guān)節(jié)腔注射法通過(guò)改變腔內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)OA，具有造模時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)。碘乙酸鈉是目前OA關(guān)節(jié)腔注射最常用的化合物，通過(guò)抑制Krebs循環(huán)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，引起軟骨基質(zhì)改變、軟骨降解丟失、滑膜炎癥等病理改變。POMONIS等［34］報(bào)道，碘乙酸鈉較木瓜蛋白酶能更好地誘導(dǎo)以疼痛為主癥的慢性關(guān)節(jié)變性，且疼痛、關(guān)節(jié)退變程度與注射時(shí)間、濃度相關(guān)，是研究OA疼痛機(jī)制、炎癥、檢測(cè)藥物療效的經(jīng)典方法。木瓜蛋白酶注射誘導(dǎo)的OA病變速度快，可模擬軟骨破壞終末階段。汪宗保等［35］以2%木瓜蛋白酶與0.03 mol/L左旋半胱氨酸的混合液注入大鼠關(guān)節(jié)腔，注射后4～6周成功誘導(dǎo)早期OA。膠原酶通過(guò)分解軟骨細(xì)胞間基質(zhì)膠原蛋白誘導(dǎo)OA。劉軍等［36］采用關(guān)節(jié)腔注射膠原酶誘導(dǎo)的KOA類(lèi)似于老年鼠自發(fā)OA，使用Ⅱ或Ⅳ型膠原酶造模3 d后即可觀察到OA病理改變。

寒冷刺激血管收縮可致血運(yùn)不暢，組織缺血缺氧，關(guān)節(jié)液成分改變，釋放炎癥因子誘發(fā)OA。林強(qiáng)等［37］以石膏將大鼠四肢每日4 h固定于4℃涼水誘導(dǎo)OA，6周后觀察到軟骨損傷，血清及滑膜中IL-1β、TNF-α、PGE2、COX-2、γ干擾素水平均升高。該造模方法常用于中醫(yī)陽(yáng)虛寒凝、寒濕痹阻型OA的實(shí)驗(yàn)研究。

血循阻斷法通過(guò)阻斷血流導(dǎo)致骨內(nèi)高壓，關(guān)節(jié)內(nèi)靜脈回流受阻、動(dòng)脈灌注不足，軟骨組織營(yíng)養(yǎng)供給不足誘發(fā)OA。戴七一等［38］結(jié)扎動(dòng)物臀下靜脈、股靜脈及大隱靜脈，8周后建立了早中期KOA動(dòng)物模型。此種造模方法亦可用于中醫(yī)氣滯血瘀型OA研究。

OA分型化可提高研究的針對(duì)性與準(zhǔn)確性，研究者可根據(jù)不同表型實(shí)驗(yàn)需要，結(jié)合動(dòng)物及造模方法優(yōu)缺點(diǎn)，選擇最適宜的動(dòng)物用于研究。但目前尚無(wú)OA造模公認(rèn)的操作及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，存在較大的探索空間。