NAC抗氧化應(yīng)激治療對(duì)糖尿病小鼠骨髓干細(xì)胞增殖和凋亡的影響

秦淑蘭，寧紅紅，朱艷，盛霞，何琪，鄧波，李志紅，黃文濤

1南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院，南昌330008；2井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院；3南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院

2型糖尿病患者合并缺血性疾?。ㄈ绻谛牟?、缺血性心肌病等）的發(fā)病率增高，常規(guī)藥物及手術(shù)治療效果欠佳。研究表明，骨髓干細(xì)胞可通過(guò)歸巢，聚集并融入缺血組織附近，分化發(fā)展成血管內(nèi)皮細(xì)胞；其還可以分泌血管生長(zhǎng)因子，參與組織損傷修復(fù)和血管再生［1-2］。近年來(lái)，自體骨髓干細(xì)胞移植治療缺血性疾病得到廣泛應(yīng)用，但在糖尿病人群中自體骨髓干細(xì)胞移植治療缺血性疾病的療效欠佳。氧化應(yīng)激與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，糖尿病患者氧化應(yīng)激與抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)之間的平衡受損，導(dǎo)致過(guò)氧化應(yīng)激；過(guò)氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞DNA和膜脂損傷，增加凋亡相關(guān)基因表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡［3］。而骨髓干細(xì)胞的增殖和凋亡能力與糖尿病治療效果明顯相關(guān)，因此推測(cè)，糖尿病狀態(tài)下的過(guò)氧化應(yīng)激可促使骨髓干細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致骨髓干細(xì)胞移植治療效果欠佳。N-乙?；腚装彼幔∟AC）是一種含巰基的抗氧化物，是還原性谷胱甘肽的前體，能提高谷胱甘肽（GSH）水平，減少活性氧（ROS）及8-異前列腺素（8-Isoprostane）的生成［4］。NAC廣泛應(yīng)用于心腦血管及呼吸系統(tǒng)疾病的治療，但目前有關(guān)NAC用于糖尿病合并缺血性疾病患者抗氧化應(yīng)激治療方面的研究較少。2017年1月—2020年1月，我們觀察了NAC抗氧化應(yīng)激治療對(duì)糖尿病小鼠骨髓干細(xì)胞增殖和凋亡的影響，旨在為NAC治療糖尿病合并缺血性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Balb/c雄性小鼠18只，8～10周齡，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于室溫、濕潤(rùn)、通風(fēng)良好環(huán)境，予以普通飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 STZ（美國(guó)Sigma），2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酯（DCFDA）（美國(guó)Invitrogen），ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Cayman Chemical），EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），DAPI染色液（美國(guó)Sigma），細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD Biosciences）。流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beck?man Coulter），血糖儀（美國(guó)強(qiáng)生），MiniMACS Separa?tor磁珠分離器（德國(guó)Miltenyi），倒置熒光顯微鏡（日本NIKON）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Sigma）。

1.2 模型制備 小鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg（以pH4.4的無(wú)菌檸檬酸緩沖液稀釋），每天1次，連續(xù)5 d。注射結(jié)束后第3天采集尾部靜脈血，測(cè)隨機(jī)血糖，>15 mmol/L為糖尿病模型制備成功。

1.3 動(dòng)物分組與干預(yù) 取造模成功的10只小鼠，隨機(jī)分成治療組和對(duì)照組各5只。治療組給予NAC 200 mg/（kg·d）腹腔注射，對(duì)照組給予等量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)4周。

1.4 尿液8-Isoprostane水平檢測(cè) 收集小鼠尿液，使用ELISA試劑盒檢測(cè)8-Isoprostane水平。

1.5 骨髓干細(xì)胞的分離 采用頸椎脫臼法處死小鼠。無(wú)菌條件下取股骨及脛骨，使用生理鹽水沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液。使用比重離心液去除紅細(xì)胞，通過(guò)免疫磁珠分離法獲得CD117+骨髓干細(xì)胞。

1.6 骨髓干細(xì)胞ROS水平檢測(cè) 取新鮮分離的CD117+骨髓干細(xì)胞，在37℃下與DCFDA孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平。

1.7 骨髓干細(xì)胞增殖能力觀察 取新鮮分離的骨髓干細(xì)胞，按1×104/孔接種于24孔板。待細(xì)胞貼壁后，加入EdU檢測(cè)試劑盒中的EdU工作液（終濃度為10μmol/L）孵育3 h。PBS清洗，4%多聚甲醛固定，甘氨酸中和，檢測(cè)DNA復(fù)制期間的EdU。DAPI染核，熒光顯微鏡下計(jì)算陽(yáng)性染色（紅色）細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算陽(yáng)性染色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)，以此代表細(xì)胞增殖能力。

1.8 骨髓干細(xì)胞凋亡情況觀察 取新鮮分離的骨髓干細(xì)胞1×104個(gè)，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書加入Annexin V-FITC和PI染色，避光孵育30 min，用熒光顯微鏡觀察染色情況，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用Student'st檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 治療組和對(duì)照組尿液8-Isoprostane水 平 分 別 為（2.404±0.823）、（13.160±5.169）ng/mL，治療組低于對(duì)照組（P<0.05）；兩組骨髓干細(xì)胞ROS水平分別為（173.9±22.3）、（282.0±21.4），治療組低于對(duì)照組（P<0.01）。

2.2 兩組骨髓干細(xì)胞增殖能力比較 治療組和對(duì)照組EdU陽(yáng)性率分別為8.6%±0.8%、7.2%±0.3%，治療組EdU陽(yáng)性率高于對(duì)照組（P<0.05）。

2.3 兩組骨髓干細(xì)胞凋亡率比較 治療組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為8.4%±0.6%、12.6%±0.7%，治療組細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照組（P<0.05）。

3 討論

骨髓干細(xì)胞是一種具有高度自我更新、強(qiáng)分化潛能及多重分化活性的細(xì)胞，其細(xì)胞標(biāo)志物包括CD117和CD34［5］。近年來(lái)，自體骨髓干細(xì)胞移植治療缺血性疾病，比如在缺血性心臟病治療中獲得廣泛應(yīng)用。多項(xiàng)研究顯示，干細(xì)胞移植對(duì)缺血性心臟病的心臟修復(fù)有良好效果［6-8］。但在糖尿病合并缺血性疾病的患者中，自體骨髓干細(xì)胞移植治療效果欠佳。GOVAERT等［9］和JIMéNEZ-QUEVEDO等［10］報(bào)道，糖尿病合并缺血性心臟病患者給予骨髓干細(xì)胞移植后，心臟收縮末期容積無(wú)明顯下降，其原因與骨髓干細(xì)胞移植后的增殖能力下降和凋亡率升高有關(guān)。PFISTER等［11］研究證實(shí)，骨髓干細(xì)胞的生存能力降低直接影響糖尿病患者缺血組織的血管新生效果。FISHER等［12］系統(tǒng)回顧分析了有關(guān)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獨(dú)立治療不符合血運(yùn)重建條件的缺血性心臟病患者的相關(guān)文獻(xiàn)，其結(jié)論為骨髓干細(xì)胞的凋亡影響糖尿病合并缺血性心臟病患者的心臟射血分?jǐn)?shù)及心功能的恢復(fù)。

在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，自由基產(chǎn)生增多和抗氧化應(yīng)激能力減弱二者并存，從而易發(fā)生氧化應(yīng)激，其產(chǎn)物ROS在細(xì)胞DNA損傷、細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［13］。NAC是L-半胱氨酸的乙?；问?，作為半胱氨酸的來(lái)源，NAC能夠增加血液中的GSH水平，是一種清除ROS的有效抗氧化劑。既往研究發(fā)現(xiàn)，NAC具有激活Nrf2/HO-1抗氧化信號(hào)通路、抑制NF-κB炎癥激活信號(hào)通路以及抑制HA誘導(dǎo)的炎癥基因表達(dá)等作用［14-15］。因此推測(cè)，NAC可能改善糖尿病患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

氧化應(yīng)激被定義為ROS產(chǎn)生和消除之間的不平衡，這種不平衡與各種炎癥相關(guān)的疾病有關(guān)。ROS可以氧化脂質(zhì)，脂質(zhì)碎裂產(chǎn)生F2-異前列烷（F2-Isoprostane）。8-Isoprostane是目前研究最廣泛的F2-Isoprostane之一，它是脂質(zhì)過(guò)氧化物的標(biāo)志物，也人類研究中評(píng)估氧化應(yīng)激最常用的生物標(biāo)志物。在人類和動(dòng)物模型中，NAC已被證實(shí)可以改善機(jī)體過(guò)氧化應(yīng)激、抑制炎癥以及ROS的增加［16］。EBERLEIN等［15］研究顯示，抗氧化劑NAC能抑制炎癥基因的表達(dá)，有助于重新平衡過(guò)度ROS誘導(dǎo)的炎癥。PALLI等［17］研究結(jié)果顯示，ICU患者經(jīng)NAC治療后，血清8-Isoprostane水平顯著降低。本研究結(jié)果顯示，NAC治療組尿液8-Isoprostane水平較對(duì)照組顯著下降，骨髓干細(xì)胞中ROS水平也顯著下降。這表明NAC治療對(duì)糖尿病小鼠及其骨髓干細(xì)胞具有顯著抗氧化應(yīng)激作用。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，治療組細(xì)胞增殖能力提高，細(xì)胞凋亡率降低，表明NAC可減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。我們認(rèn)為NAC是通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)ROS水平和GSH氧化，進(jìn)而防止細(xì)胞的早期凋亡發(fā)生。其機(jī)制可能包括以下幾個(gè)方面：①GSH缺失會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致ROS積累、線粒體功能障礙和DNA損傷［18-19］；NAC可通過(guò)降低ROS水平，同時(shí)增加GSH水平，進(jìn)而減少細(xì)胞的凋亡。②抗凋亡蛋白（Bcl-2）家族的Bcl-XL和mcl1的表達(dá)受PI3K/AKT通路調(diào)控，ROS可抑制PI3K/AKT通路，促使細(xì)胞早期凋亡［20-21］，NAC可通過(guò)抑制ROS生成來(lái)改善PI3K/Akt信號(hào)通路表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生［22］。③NAC可抑制細(xì)胞中參與凋亡過(guò)程的Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)［23］。

綜上所述，NAC可有效改善糖尿病小鼠的氧化應(yīng)激水平，促進(jìn)骨髓干細(xì)胞增殖并減少細(xì)胞的早期凋亡。未來(lái)我們將進(jìn)一步探討NAC抗氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡之間的具體分子機(jī)制，為糖尿病抗氧化應(yīng)激治療提供更多理論基礎(chǔ)。