精準醫(yī)學在疑難肝病中的應用

孔曉飛

2008年，12歲的Elana Simon被診斷為一種罕見的肝臟腫瘤——纖維板層型肝細胞癌(FL-HCC)，這是一種好發(fā)于年輕人的惡性肝臟腫瘤，部分患者因出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移、沒有有效治療的方法而死亡[1]。Elana在紐約斯隆腫瘤中心(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)完成肝臟腫瘤切除手術，而她的父親Sanford Simons是一位國際著名的細胞生物學家，研究細胞內(nèi)不同囊泡之間的蛋白轉(zhuǎn)運，因為女兒的疾病轉(zhuǎn)而開始研究一個全新方向——纖維板層型肝細胞癌。他采用全外顯子測序和腫瘤細胞核糖核酸測序(RNA-Seq)技術對15例類似患者的腫瘤進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)所有患者遺傳學上存在基因缺失的共同特點，兩個相鄰的基因DNAJB1和PRKACA之間一段DNA序列消失，在mRNA水平DNAJB1和PRKACA之間形成一種嵌合狀態(tài)。PRKACA在正常肝細胞中處于低表達狀態(tài)，而由于其固有基因調(diào)控區(qū)域的缺失，PRKACA受到DNAJB1的啟動子調(diào)節(jié)，導致嵌合的PRKACA基因過度表達，而PRKACA基因編碼一個具備激酶活性的蛋白，引起癌變。Elana作為一名高中生，學習之余在父親的實驗室研究自己的疾病，并在《科學》雜志報道了研究成果，受到總統(tǒng)接見，19歲時進入哈佛大學讀本科[2]。她的故事還在延續(xù)，在后續(xù)的研究中她研究了嵌合激酶引起的下游基因活化，而其他課題組則構(gòu)建了動物模型，篩選可以治療此病的藥物[3]。Elana的故事很有感染力，她是一名年輕的患者，也是一位科研人員，在精準醫(yī)學計劃(Precision Medicine Initiative)的啟動儀式上，她用自己的經(jīng)歷告訴大家，要從臨床現(xiàn)象出發(fā)，研究現(xiàn)象背后的本質(zhì)，理解年輕的她們或者應該說是“我們”，為什么會患這樣稀奇古怪的疾病，有什么樣的辦法可以治愈？在大學期間，筆者的母親診斷為不明原因肝硬化，遺憾的是她沒有Elana這樣的資源，在過去近二十年的臨床和科研中，筆者先后在上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院、巴黎Necker兒童醫(yī)院、紐約洛克菲勒大學和哥倫比亞大學學習與工作，試圖用遺傳的方法，以患者的需求為出發(fā)點，以解決臨床問題作為目的，探索基因與疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系。

本文旨在回顧和展望目前精準醫(yī)學在肝臟疾病中的應用進展，從纖維板層型肝細胞肝癌的遺傳學研究入手，強調(diào)精準醫(yī)學在人類遺傳大數(shù)據(jù)的進展和戰(zhàn)略性計劃，闡述精準醫(yī)學中易患人群、學術界和企業(yè)之間的相互關系，回顧一些具有影響力的遺傳改變引起的肝臟疾病，包括代謝或免疫相關的肝臟疾病，展望人工智能在肝臟疾病的臨床與遺傳診斷之間的轉(zhuǎn)化作用。

一、精準醫(yī)學的起源與興起

精準醫(yī)學(Precision Medicine)的起源來自于對遺傳認知和分析技術的不斷進步[4]，孟德爾的豌豆，達爾文的鳥嘴，摩爾根的果蠅，從Crick-Waterson的雙螺旋結(jié)構(gòu)到Oswald Avery的轉(zhuǎn)化因子試驗，從定位克隆到人類基因組計劃，從認識染色體到基因序列分析，從誘導多能干細胞到基因編輯，從電子病歷系統(tǒng)到人工智能，涌現(xiàn)出了一系列影響人類未來的技術性革命。二十一世紀是生命醫(yī)學的世紀，在這個歷史進程之中，基礎科學的進步將給臨床實踐帶來質(zhì)的飛越，試想如果沒有核酸檢測技術，在一線戰(zhàn)斗的我們又如何能鑒別感染性肺炎是由新型冠狀病毒所引起？2005年前后，第二代測序技術開始廣泛應用于DNA和RNA的序列分析中，與傳統(tǒng)的第一代測序相比，二代測序可以同時對人類所有基因進行序列分析，產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)，而對這些數(shù)據(jù)進行篩選，可以評估獲得對疾病預防、診斷和治療具有實際價值的信息。精準醫(yī)學有別于隨機對照雙盲的臨床試驗，是強調(diào)個體化的方案，在軀體上表現(xiàn)出來的一種臨床疾病，盡管一群該病患者看上去很相似，而實際上各有各的區(qū)別。靶向和個體化治療已經(jīng)在腫瘤的臨床診治中廣泛運用。根據(jù)腫瘤遺傳學特征，如果發(fā)現(xiàn)Bcl-Abl融合基因或C-Kit基因變異，就可以采用靶向藥物格列衛(wèi)治療。精準醫(yī)學的研究目的是尋找與個體疾病直接相關的遺傳和環(huán)境因素，廣泛采用各種組學技術，而基因組學技術是精準醫(yī)學的核心組成部分。

為了推動精準醫(yī)學在臨床中的應用，美國各大臨床醫(yī)學中心紛紛成立直接服務于臨床的遺傳檢測機構(gòu)、或隸屬于病理系、或完全獨立的分子遺傳或基因組學中心，亦有遺傳研究基礎雄厚的臨床科室直接擔負重任。美國國立人類基因組研究所設立了與臨床遺傳相關的多中心研究項目，如腫瘤遺傳圖譜、臨床基因組資源(ClinGen)、電子病歷和基因組學網(wǎng)絡(eMerge)、新生兒測序和公共衛(wèi)生(NSIGHT)、未診斷疾病網(wǎng)絡(UDN)[5]，同時也有倫理和法律相關的研究，這些研究項目是人類基因組計劃的延續(xù)，也為臨床遺傳診斷提供了參考藍圖和信息資源。以ClinGen為例[6]，他們對導致人類單基因疾病的致病基因和相關變異進行了整理和分析，對既往報道有誤的突變進行校正。以疾病類型分類，多個臨床遺傳專家根據(jù)現(xiàn)有的遺傳和臨床數(shù)據(jù)進行分析，來判斷某個突變是否具有臨床診斷價值，并以美國醫(yī)學遺傳協(xié)會(ACMG)臨床遺傳診斷指南為依據(jù)發(fā)布報告。UDN以美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)為網(wǎng)絡核心，提供多中心項目配套支持，為遺傳疾病的診斷、基因功能分析和資源統(tǒng)一及整合提供基礎。2015年啟動精準醫(yī)學計劃后，All of Us計劃對生活在美國的不同族裔總計一百萬人進行健康研究。All of Us計劃收集電子病歷數(shù)據(jù)、健康問卷、體格檢查資料、電子健康資料及對生物學標本的系統(tǒng)分析(包括遺傳分析)[7]。目前大規(guī)模的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)Genome Aggregation Database(Gnomad)、Exome Variant Server(EVS)、HGMD、ClinVar成為臨床遺傳診斷中不可或缺的工具。除政府之外，一些生物制藥公司將目光瞄準遺傳資源，研究中所發(fā)現(xiàn)的遺傳改變成為治療疾病的靶向，如Regeneron公司與Geisinger醫(yī)院合作對數(shù)十萬美國賓夕法尼亞州居民進行遺傳體檢，發(fā)現(xiàn)了脂肪肝和肝硬化相關的保護基因，而公司與醫(yī)療系統(tǒng)遺傳合作的這一趨勢目前仍在擴大。在歐洲，Orphanet為罕見病患者和孤兒藥提供信息服務，英國的生物樣本庫(UK Biobank)有近50萬志愿者的遺傳和長期隨訪臨床數(shù)據(jù)，科研人員可以申請開放研究計劃。如果沒有這些遺傳基礎設施建設，單純討論一種疾病的精準醫(yī)學應用則是水中月，夢中花。

二、代謝相關疾病的肝臟表現(xiàn)

在歐美國家，脂肪肝儼然已成為肝臟的“頭號殺手”脂肪肝導致的終末期肝臟病已經(jīng)成為接受肝移植的首要原因。脂肪肝在臨床上表現(xiàn)多樣，有肥胖直接相關的脂肪肝，也有體重正常的脂肪肝。根據(jù)病理表現(xiàn)是否有炎癥將非酒精性脂肪肝分為非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

代謝研究的輝煌時期是五十年前，通過生物化學的方法來研究各種代謝所需的底物、關鍵酶和下游產(chǎn)物。Banting發(fā)現(xiàn)了胰島素，李卓浩發(fā)現(xiàn)了促腎上腺皮質(zhì)激素。一只被稱為ob/ob的肥胖小鼠引起Jeffrey Friedman關注，歷時8年，在遺傳標志位點稀缺的時代，成功克隆了瘦素基因(Leptin)[8]。臨床上目前有瘦素、瘦素受體、MC4R、SIM1等單基因缺陷引起的能量平衡障礙，并導致肥胖和脂肪肝的發(fā)生。Hobbs等[9]在達拉斯心臟研究隊列中通過關注臨床表現(xiàn)極端罕見的患者，發(fā)現(xiàn)PCSK9基因及其在膽固醇調(diào)節(jié)中具有重要作用，而針對PCSK9的單抗藥物目前已用于臨床高脂血癥患者，尤其是對他汀類藥物治療無效的患者。Helen Hobbs的團隊在脂肪肝遺傳因素的研究中還發(fā)現(xiàn)了PNPL3基因與脂肪肝的相關性，其團隊和Regeneron同時報道了HSD17B13基因在脂肪肝和其他慢性肝病中的保護作用，而目前眾多的制藥企業(yè)已將HSD17B13作為治療脂肪肝的靶向開發(fā)藥物[10-11]。

脂肪在肝臟中的異常堆積還可以出現(xiàn)在一些罕見的肝臟疾病中。急性妊娠脂肪肝(AFLP)是一種起病急、同時危及母嬰安全的疾病。2005年一名27歲的女性妊娠患者出現(xiàn)急性肝衰竭，伴膽酶分離、凝血功能異常、肝性腦病、腦水腫、低血糖、急性腎功能衰竭，在行緊急剖腹產(chǎn)術后，病情依然惡化，李宏為教授的肝移植團隊對該患者行肝移植術，一個月后母嬰轉(zhuǎn)危為安[12]。切除的肝臟病理檢查結(jié)果提示肝細胞廣泛微小囊泡狀脂肪滴沉積，查閱文獻提示線粒體脂肪酸代謝通路的異?？梢鸫瞬。谑窃趶埿佬澜淌诘闹笇拢覀儗颊呒捌浼覍龠M行脂肪酸代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜分析，并對長鏈脂肪酸脫氫酶基因(LCHAD)進行測序，但并未發(fā)現(xiàn)基因缺陷。雖然是一個陰性的遺傳結(jié)果，但這名患者卻指引我們繼續(xù)考慮遺傳學在臨床肝病上的應用。此后，我們陸續(xù)收集到一些肝功能檢查結(jié)果反復異常、臨床病理診斷為脂肪肝的患者。一個家庭中兩名十幾歲的男孩轉(zhuǎn)氨酶始終在200 IU/ml左右，保肝降酶處理并不能解決實際問題，這兩名患者還偶爾有低血糖并伴肌酶異常，且在脂肪酸質(zhì)譜檢查時發(fā)現(xiàn)存在中鏈脂肪酸水平明顯升高。李新華博士排除了其中鏈脂肪酸脫氫酶缺陷(MCAD)和Ⅰ型糖原累積癥的可能，在對患者臨床代謝信息進一步整理和擴大疑似基因范圍后，發(fā)現(xiàn)這兩個患者都是Ⅲ型糖原累積癥[13]。遺傳學上的確診為臨床治療提供了直接指導依據(jù)，這一結(jié)果與國際上報道的糖原累積癥引起的脂肪肝不謀而合。

肝臟作為重要的代謝器官，臨床醫(yī)生一方面要意識到廣泛鑒別診斷的重要性，同時也需要一個可以協(xié)作的會診中心。在過去的臨床實踐和遺傳研究中，先后對患有紅細胞生成型原卟啉病[14]、急性間隙性卟啉病[15]、Wilson’s病、血色素病、溶酶體病、先天性糖基化障礙、原發(fā)性高草酸尿癥、囊性纖維化、抗胰蛋白酶缺陷的肝臟病患者進行了遺傳診斷和隨訪治療，這些遺傳疾病的診斷與對應靶向孤兒藥物應用已經(jīng)越來越受到重視。

三、遺傳缺陷和肝臟感染與炎癥

目前，病毒性肝炎仍是危害人類健康的重要疾病，對病毒性肝炎宿主遺傳易感性的研究由來已久，是否存在單基因缺陷從而導致病毒性肝炎感染相關的嚴重臨床表現(xiàn)目前仍在探索之中，而全基因關聯(lián)分析(GWAS)結(jié)果對臨床的指導價值有限。在這個領域可以關注周剛橋、賀福初、Andrian V.S Hill、David Goldstein等在遺傳易感性[16]、干擾素治療應答方面的研究。我們曾嘗試過在乙型肝炎病毒(HBV)感染中采用病例對照設計研究干擾素相關基因單核苷酸基因多態(tài)性與臨床表型的相關性，主要問題是明顯的統(tǒng)計學差異下微弱的相對危險度。近年來李文輝團隊發(fā)現(xiàn)HBV受體SLC10A1(NTCP)其中基因的一個S267F單核苷酸多態(tài)性(SNP)在體外的細胞學研究中存在功能障礙，部分報道稱該SNP與HBV患者的臨床預后具有相關性[17]，但未能在大規(guī)模的GWAS數(shù)據(jù)中證實[18]。在丙型肝炎病毒(HCV)感染領域，隨著Sofia等[19]對原藥進行開創(chuàng)性的側(cè)鏈改造，研發(fā)可以治愈HCV的關鍵藥物索非布韋，目前用于支持丙型病毒性肝炎的研究基金急劇萎縮，而在臨床一線甚至已將HCV感染者作為肝移植的供體。

病毒感染導致暴發(fā)型肝炎是一種臨床罕見的急性肝衰竭，患者既往無肝臟疾病史，起病2周內(nèi)出現(xiàn)以凝血障礙和肝性腦病為主的癥候群，病理結(jié)果表現(xiàn)為大片肝組織壞死。我的博士導師Jean-Laurent Casanova一直致力于兒童重癥感染與單基因缺陷的研究。最近在一例近親結(jié)婚的家系里，先證者在感染甲型肝炎病毒后發(fā)生肝衰竭，通過家系全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)先證者存在常染色體隱性(AR)白細胞介素(IL)-18BP缺陷，IL-18BP能夠抑制炎癥反應的過度激活，而IL-18BP的缺陷導致免疫系統(tǒng)攻擊肝細胞，類似與炎癥風暴中看到的肝臟損傷[20]。在單基因缺陷導致的免疫缺陷性疾病中，一系列患者出現(xiàn)肝臟問題，STAT-1基因能夠調(diào)節(jié)三種不同亞型干擾素的應答，播散性皰疹病毒感染[EB病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)、人皰疹病毒(HHV)-6]引起重癥肝損傷在AR STAT-1完全缺陷患者中已有報道。Ⅰ型干擾素受體IFNAR1和IFNAR2完全缺陷患者可以出現(xiàn)接種活疫苗之后的嚴重感染，包括由麻腮風三聯(lián)疫苗(MMR)、黃熱病毒疫苗引起的肝臟損害，均可能出現(xiàn)繼發(fā)性噬血細胞淋巴細胞增生癥(HLH)[21-22]。在單基因缺陷導致的自身免疫性淋巴細胞增生性增殖癥(ALPS)中，患者存在淋巴細胞凋亡障礙，90%患者有脾腫大，40%～50%的患者出現(xiàn)肝腫大，F(xiàn)ADD基因缺陷的患者出現(xiàn)嚴重肝臟病變[23]。肝內(nèi)金黃色葡萄球菌感染引起的膿腫在慢性肉芽腫病患者中時有報道[24]，而肺炎克雷伯氏菌感染導致的肝臟膿腫其遺傳因素尚在研究中。肝內(nèi)侵襲性真菌感染在功能獲得型(Gain-of-function)STAT1和AR CARD9缺陷患者中被報道[25]。此外，隱孢子蟲引起的膽道感染、膽管炎和肝硬化是IL-21受體(AR IL-21R)完全缺陷的重要臨床表現(xiàn)[26]。

部分原發(fā)性免疫缺陷的患者臨床可以出現(xiàn)自身免疫性肝炎的表現(xiàn)，如AIRE基因缺陷導致的自身免疫多內(nèi)分泌腺病綜合征(APECED)。普通異變型免疫缺陷(CVID)又稱遲發(fā)性低丙種球蛋白血癥，其臨床表現(xiàn)譜極廣泛，患者有反復慢性感染，IgG水平低下，對疫苗應答差。CVID既可能是單基因引起的免疫缺陷，也可以是多基因參與致病，致病基因涵蓋ICOS、TACI、BAFF-R、PIK3CD等，這一系列基因在B淋巴細胞發(fā)育、增殖和分化中具有重要功能。自身免疫病、淋巴細胞增殖性疾病和腫瘤在CVID患者中并不罕見。在部分CVID患者中可以同時出現(xiàn)免疫性腸病(如乳糜瀉[Celiac Disease)]和肝臟疾病，后者可以表現(xiàn)為堿性磷酸酶升高、NRH、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)/原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)，甚至發(fā)展為肝硬化和肝癌[27]。

四、肝臟疾病遺傳診斷的人工智能開發(fā)

在基因和臨床表型因果關系中，目前OMIM數(shù)據(jù)庫已知引起肝臟異常的單基因疾病共涉及400余基因，在筆者過去的臨床遺傳診斷中，有JAG1基因變異導致的Alagille綜合征，或NOTCH相關基因變異引起的膽道閉鎖，凝血因子V基因缺陷導致的肝內(nèi)血栓，HNF1A變異引起的肝細胞腺瘤，TALDO1基因(轉(zhuǎn)醛醇酶)變異引起的肝病，顯性和隱性多囊腎多囊肝，膽汁代謝障礙和進行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積癥。隨著二代測序的普及，單基因缺陷導致的肝臟疾病仍在不斷的增長，如膽道閉鎖患者與PKD1L1[28]、非特異性門脈高壓癥患者與DGUOK[29]、反復肝衰竭與NBAS和RINT1[30-31]等。

如何利用臨床數(shù)據(jù)和下一代基因測序分析對疑難肝臟疾病進行快速準確的診斷是很多科研人員關心的問題。一套人工智能診斷系統(tǒng)勢在必行，部分研究已經(jīng)開始將人工智能應用于臨床，如把OMIM單基因疾病所涉及的臨床問題換成ICD-10，一個基因?qū)獢?shù)個相關的ICD-10；而在遺傳方面，把400余個肝臟相關基因的致病變異進行標記。這樣一方面能在患者電子病歷中調(diào)用ICD-10 code，尋找OMIM中可能的疾病，另一方面從測序的結(jié)果中篩查可能致病的突變，再返回OMIM之中尋找最佳的臨床表型-基因型的配對，以此對患者進行快速的遺傳診斷[32]。

綜上所述，隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，我們通過遺傳研究不斷更新知識，認清疾病的本質(zhì)，也為未來醫(yī)學科學的發(fā)展提供方向。