超臨界CO2萃取粉末磷脂的研究

高佳佳 王偉寧 郝凱越 朱秀清 王立琦 于殿宇 潘明喆 羅淑年

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030)(哈爾濱商業(yè)大學(xué)2，哈爾濱 150028)(九三集團(tuán)惠康食品有限公司3，哈爾濱 150069)

超臨界CO2萃取技術(shù)具有無化學(xué)溶劑消耗和殘留、對環(huán)境無污染、萃取效率高、易回收、工藝簡單、操作溫度較低可有效保護(hù)熱敏的活性物質(zhì)、得到的產(chǎn)物的品質(zhì)和純度高等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于油脂等功能性成分的制備[1-4]。

黑龍江省是國家最大的非轉(zhuǎn)基因大豆生產(chǎn)區(qū)[5-7]，由于環(huán)境及運輸問題，植物油料中會含有多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocabons，PAHs)[8-9]，這些親脂性的PAHs在大豆加工過程作會進(jìn)入到油相[10]，大豆磷脂作為一種天然表面活性劑[11]，具有較強的吸附作用，在油脂精煉過程中PAHs會逐漸富集在磷脂表面，食品添加劑聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA)認(rèn)為人類主要通過谷類制品和植物油脂攝入PAHs[12]，具有慢性毒性和致癌、致畸、致突變的“三致”作用[13-15]。

大豆油腳是大豆油精煉時的重要副產(chǎn)物，大豆毛油經(jīng)過脫膠得到油腳，油腳經(jīng)真空脫水后得到大豆?jié)饪s磷脂[16-19]，大豆?jié)饪s磷脂是一類淺棕色或淡黃色半透明稠狀物質(zhì)，具有一定的功能特性，略微帶有豆腥味，容易氧化變性[20-25]。

大豆粉末磷脂是從大豆?jié)饪s磷脂中進(jìn)一步提純得到的，其具有降血脂、抗脂肪肝、防衰老、兒童健腦益智等作用，已作為多種保健品組方的關(guān)鍵成分，也是大豆磷脂深加工起始原料[26]。目前工業(yè)化生產(chǎn)常用溶劑萃取法制備大豆粉末磷脂，利用磷脂不溶于丙酮，而油脂及其它脂溶性物質(zhì)均易溶于丙酮特性，將大豆?jié)饪s磷脂經(jīng)脫油除雜，再經(jīng)干燥后制取粉末磷脂[27]，溶劑萃取法溶劑用量和損耗過大，存在毒性會對環(huán)境造成污染[28]，溶劑萃取法得到的大豆粉末磷脂含有一定量的雜質(zhì)及PAHs，同時溶劑殘留限制了大豆粉末磷脂在高檔食品以及乳品行業(yè)中的應(yīng)用，以及轉(zhuǎn)基因問題限制了其在藥品行業(yè)的應(yīng)用。此外，普通大豆粉末磷脂的HLB值約為6～7[29]，而本文采用的超臨界CO2萃取法選擇不添加夾帶劑，二氧化碳可以充分發(fā)揮溶解和擴散能力強的優(yōu)點，與原料顆粒充分接觸，有效地將顆粒中所含的油類物質(zhì)帶走[30]，由此得到的大豆粉末磷脂的HLB值很可能會提高，從而進(jìn)一步增強大豆粉末磷脂的親水性，使其應(yīng)用范圍更加廣泛。

因此，本研究以非轉(zhuǎn)基因大豆?jié)饪s磷脂為原料，選擇正己烷作為溶劑，通過添加不同特性的吸附劑，以期脫除PAHs及雜質(zhì)。并在超臨界CO2狀態(tài)下，研究萃取的壓力，溫度，時間，對大豆粉末磷脂萃取效率的影響，以期生產(chǎn)高品質(zhì)的非轉(zhuǎn)基因大豆粉末磷脂，拓寬非轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品市場。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

大豆?jié)饪s磷脂：外購，經(jīng)檢測PAH16的含量為38.2 μg/kg，酸價為18.53 mg/g，其他組分為：不溶性雜質(zhì)0.3%、丙酮不溶物60.17%、水分及揮發(fā)物1.0%。

正己烷、3，5-二硝基水楊酸、乙醚(分析純)和丙酮。

白土；凹凸棒；硅藻土+助濾劑；進(jìn)口活性碳8018-8；進(jìn)口活性碳8017-6。

1.1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；LD4-2A型低速臺式離心機；Ha121-50-013L×2超臨界CO2萃取設(shè)備；恒溫水浴鍋；SHB-Ⅲ-循環(huán)水式多用真空泵；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；HG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；722型可見分光光度計；G4號砂芯漏斗等。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃縮磷脂中不溶性雜質(zhì)及多環(huán)芳烴的去除

稱取大豆?jié)饪s磷脂100 g于1 000 mL三角瓶中，向其中添加不同量的正己烷，渦旋震蕩使大豆?jié)饪s磷脂充分溶解，添加一定量的吸附劑于三角瓶中，搖晃，充分混勻，放入轉(zhuǎn)子。水浴升溫至指定溫度，調(diào)整攪拌速度，冷凝回流2 h，靜置1.5 h后，在3 000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集大豆?jié)饪s磷脂進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，脫除溶劑，得到精制大豆?jié)饪s磷脂。

1.2.2 粉末磷脂萃取試驗1.2.2.1 單因素試驗

將精制大豆?jié)饪s磷脂加入料筒并放入萃取罐中，裝好壓環(huán)和密封圈，旋緊上堵頭，在操作面板的控溫儀上設(shè)定萃取溫度分別為40～65 ℃，進(jìn)行加熱，設(shè)定CO2流量為28 L/h，調(diào)節(jié)壓力控制閥門，待萃取壓力分別為20～45 MP時，開始循環(huán)萃取，并保持恒壓恒溫，分別循環(huán)萃取30～180 min后，從萃取罐取出料筒，將磷脂取出進(jìn)行稱量，計算粉末磷脂萃取率。

1.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計，以萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、萃取時間(C)為自變量，以萃取率(R)為響應(yīng)值設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，表1為響應(yīng)面因素與水平表。

表1 響應(yīng)面因素與水平表

1.2.3 不溶性雜質(zhì)含量測定

參照GB/T 1 5688—2008《動植物油脂 不溶性雜質(zhì)含量的測定》進(jìn)行檢測。

1.2.4 不溶性雜質(zhì)含量的計算

(1)

式中：w0為樣品的質(zhì)量/g；w1為干過是過濾器的質(zhì)量/g；w2為坩堝式過濾器及干殘留物的質(zhì)量/g。

1.2.5 多環(huán)芳烴含量測定與計算

參照GB 5 009.265—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多環(huán)芳烴的測定》進(jìn)行檢測。

1.2.6 多環(huán)芳烴脫除率的計算

(2)

式中：w3為脫除前大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴含量/μg/kg；w4為脫除后大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴含量/μg/kg。

1.2.7 粉末磷脂萃取率的計算

(3)

式中：w5為精制大豆?jié)饪s磷脂含量/g；w6為大豆粉末磷脂含量/g。

1.2.9 HLB值的測定

用Span80和Tween80調(diào)合成標(biāo)準(zhǔn)測定所需HLB值的油作為標(biāo)準(zhǔn)油，按標(biāo)準(zhǔn)油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)配成不同需要的HLB值標(biāo)準(zhǔn)混合油，HLB值分別為9、10、11、12、13、14六個標(biāo)準(zhǔn)油。然后按m(大豆粉末磷脂)∶m(油)∶m(雙蒸水)=1∶3∶16配制，在搖床上以200r/min搖動5 min，取出分別加到標(biāo)號后的50 mL帶刻度量筒中，靜置12 h記錄分離出來的水量，最小析水量對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)油HLB值即為測定樣品HLB值。

1.3 工業(yè)化生產(chǎn)

利用試驗所得參數(shù)在工業(yè)化生產(chǎn)線上將大豆?jié)饪s磷脂加工成超臨界CO2萃取大豆粉末磷脂，并計算相應(yīng)得率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

所有指標(biāo)的測定都重復(fù)3次，試驗結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差值表示，數(shù)據(jù)采用Origin7.5進(jìn)行分析和繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 濃縮磷脂中不溶性雜質(zhì)的去除

正己烷添加量對不溶性雜質(zhì)含量的影響效果見表2

表2 正己烷添加量對不溶性雜質(zhì)含量的影響

表2可見，隨著正己烷添加量的增加，由于雜質(zhì)不溶于正己烷，因此過濾后的磷脂中的雜質(zhì)含量逐漸下降，當(dāng)添加量大于1.5 mL/g后，雜質(zhì)的含量下降不明顯，確定正己烷最適1.5 mL/g。

2.2 濃縮磷脂中多環(huán)芳烴脫除的效果

2.2.1 不同吸附劑對多環(huán)芳烴脫除效果的影響

分別添加5%的白土、凹凸棒、硅藻土+助濾劑、進(jìn)口活性碳8018-8、進(jìn)口活性碳8017-6五種吸附劑，在正己烷添加量為1.5 mL/g，溫度50 ℃，時間3 h、攪拌速度1 500 r/min的條件下進(jìn)行多環(huán)芳烴的脫除試驗，研究不同吸附劑對大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴含量及脫除率的影響，結(jié)果如表3所示。

表3 吸附劑種類對多環(huán)芳烴脫除效果的影響

由表3可以看出，在相同脫除條件下，活性炭的脫除效果明顯優(yōu)于活性白土，這與Yebra-Pimentel等[31]研究結(jié)果基本一致。此外，本試驗的結(jié)果表明凹凸棒及兩種進(jìn)口活性炭脫除大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴的效果均較好，脫除后，大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴含量分別為2.3、2.0、2.2 μg/kg，脫除率均在94%以上且相差不大，但兩種進(jìn)口活性炭價格相對較高，綜合考慮，選擇凹凸棒作為脫除大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴的吸附劑為宜。

2.2.2 吸附劑用量對多環(huán)芳烴脫除效果的影響

分別添加2%、3%、4%、5%、6%的凹凸棒，在正己烷添加量為1.5 mL/g，溫度50 ℃，時間3 h，攪拌速度1 500 r/min的條件下時進(jìn)行多環(huán)芳烴的脫除試驗，研究不同吸附劑添加量對大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴含量及脫除率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 吸附劑用量對多環(huán)芳烴含量及脫除率的影響

由圖1可以看出，大豆?jié)饪s磷脂中PAH16含量隨凹凸棒添加量的增加而降低，而脫除率隨凹凸棒添加量的增加明顯增加，當(dāng)添加量增加至5%以后PAH16及脫除率均沒有明顯變化，為節(jié)約成本，綜合考慮，選擇凹凸棒的添加量為5%。

2.2.3 時間對多環(huán)芳烴脫除效果的影響

在正己烷添加量為1.5 mL/g，凹凸棒添加量為5%，溫度50 ℃，攪拌速度1 500 r/min時分別選取時間1.5、2、2.5、3、3.5 h的條件下時進(jìn)行多環(huán)芳烴的脫除試驗，研究時間對大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴含量及脫除率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 時間對多環(huán)芳烴含量及脫除率的影響

由圖2可以看出，大豆?jié)饪s磷脂中PAH16含量隨時間的延長而降低，當(dāng)達(dá)到3 h后降低緩慢，3 h以后PAH16含量及脫除率均隨時間的延長沒有顯著降低，在保證大豆?jié)饪s磷脂產(chǎn)品質(zhì)量的基礎(chǔ)上，綜合考慮試驗及未來生產(chǎn)成本，選擇脫除時間為3 h。

2.2.4 溫度對多環(huán)芳烴脫除效果的影響

在正己烷添加量為1.5 mL/g，凹凸棒添加量為5%，時間3 h，攪拌速度1 500 r/min時分別選取溫度35、40、45、50、55 ℃的條件下時進(jìn)行多環(huán)芳烴的脫除試驗，研究溫度對大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴含量及脫除率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對多環(huán)芳烴含量及脫除率的影響

由圖3可以看出，大豆?jié)饪s磷脂中PAH16含量隨溫度的增加而降低，脫除率隨溫度的增加而增加，當(dāng)溫度升高至50 ℃以后，PAH16含量及脫除率均沒有顯著變化，因此，選擇溫度為50 ℃。

2.2.5 攪拌速度對多環(huán)芳烴脫除效果的影響

在正己烷添加量為1.5 mL/g，凹凸棒添加量為5%，溫度50 ℃，時間3 h時分別選取攪拌速度900、1 200、1 500、1 800、2 100 r/min的條件下時進(jìn)行多環(huán)芳烴的脫除試驗，研究攪拌速度對大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴含量及脫除率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 攪拌速度對多環(huán)芳烴含量及脫除率的影響

由圖4可以看出，攪拌速度越大，大豆?jié)饪s磷脂中多環(huán)芳烴的含量越低，脫除率越高，當(dāng)攪拌速度為1 500 r/min以后，PAH16含量及脫除率均沒有顯著變化，因此，選擇脫除試驗的攪拌速度為1 500r/min。

2.2.6 脫除多環(huán)芳烴及雜質(zhì)的最佳條件

當(dāng)凹凸棒添加量為5%，正己烷添加量為1.5 mL/g，溫度50 ℃，時間3 h，攪拌速度1 500 r/min的時進(jìn)行試驗，可得到不溶性雜質(zhì)含量為0.05%，多環(huán)芳烴含量為2.29 μg/kg的精制大豆?jié)饪s磷脂。

2.3 超臨界CO2萃取粉末磷脂的效果

萃取壓力主要會影響超臨界流體的密度，從而對萃取率產(chǎn)生影響[32]。設(shè)置這一過程的壓力范圍為20～45 MPa(CO2流速28 L/h、萃取溫度50 ℃、萃取時間120 min)，對精制大豆?jié)饪s磷脂進(jìn)行超臨界萃取。超臨界CO2的性質(zhì)受到萃取溫度的影響，試驗中選擇從溫度40 ℃開始，最高溫度達(dá)到65 ℃(CO2流速28 L/h、萃取壓力35 MPa、萃取時間120 min)，測定萃取溫度對粉末磷脂的萃取率的影響。超臨界CO2的性質(zhì)受到萃取時間的影響，試驗中選擇從時間30 min開始，最長時間為180 min(CO2流速28 L/h、萃取壓力35 MPa，萃取溫度為50 ℃)，測定萃取溫度對粉末磷脂萃取率的影響。

從圖5中可以看出，隨著萃取壓力的增加，萃取率成增大趨勢。當(dāng)萃取壓力達(dá)到35 MPa時，萃取率為81.34%。但隨著壓力增加，當(dāng)壓力過高時，溶質(zhì)的擴散系數(shù)減小，傳質(zhì)阻力增大，萃取能力反而下降[33]。超過35 MPa后，萃取效率又出現(xiàn)下降趨勢，因此，可選擇壓力為35 MPa進(jìn)行萃取。隨溫度升高，大豆粉末磷脂的萃取率逐漸增加，溫度50 ℃時萃取率最高，達(dá)到83.37%。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高，萃取率逐漸降低，這可能是因為溫度過高降低了超臨界流體的密度，使物質(zhì)的溶解度降低而不利于萃取[34]。因此，選擇50 ℃為宜。萃取時間越長，磷脂萃取率越高，但達(dá)到一定程度后，隨著萃取時間的延長，磷脂萃取率增加放緩。萃取時間增加，有利于超臨界流體與粉末磷脂成分的溶解平衡，這樣增加萃取時間就會增加萃取收率，但萃取時間過長，動力消耗增加，生產(chǎn)成本也會增加。兼顧經(jīng)濟效益，確定最佳萃取時間為120 min。

圖5 不同條件對粉末磷脂萃取率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 設(shè)計與結(jié)果

通過Design-Expert8.0.6軟件設(shè)計設(shè)定A(萃取壓力)、B(萃取溫度)、C(萃取時間)分別是影響因素，R(萃取率)為響應(yīng)值得到3因素3水平設(shè)計與結(jié)果，如表4所示。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.4.2 模型方差與分析

利用Design Expert8.0.6軟件對2.4.1中試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，得到回歸線方程為：

R=+82.76+2.49A-2.06B+3.55C+1.08AB+1.15AC-0.65BC-4.39A2-4.29B2-5.27C2，回歸模型的方差分析表如表5所示。

表5 回歸模型的方差分析

根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果可知，A(萃取壓力)C(萃取時間)之間交互作用極顯著，A(萃取壓力)B(萃取溫度)之間交互作用較為顯著，B(萃取溫度)C(萃取時間)交互作用對萃取率的影響相對較小。

2.4.3 超臨界CO2萃取粉末磷脂的最佳條件

通過響應(yīng)面圖及結(jié)果分析可以得出，超臨界CO2萃取粉末磷脂的最佳條件為：萃取溫度48.84 ℃，萃取壓力36.52 MP，萃取時間131.54 min。萃取率可達(dá)84.06%。考慮到試驗條件及操作實際性和便利性，將最佳條件調(diào)整為萃取溫度50 ℃，萃取壓力35 MP，萃取時間130 min。根據(jù)調(diào)整后的參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)平行試驗，得到萃取率可達(dá)83.76%，與理論預(yù)測值的偏差較小。說明利用此響應(yīng)面對超臨界CO2萃取粉末磷脂的最佳條件的優(yōu)化結(jié)果較為準(zhǔn)確，具有較好的可靠性和重現(xiàn)性。

2.5 HLB值的測定

經(jīng)測定，本實驗生產(chǎn)的大豆粉末磷脂的HLB值為8，高于普通粉末磷脂，故本試驗所得粉末磷脂的親水性比普通粉末磷脂好，應(yīng)用范圍更廣泛。

2.6 實際工業(yè)化生產(chǎn)

將上述試驗數(shù)據(jù)經(jīng)優(yōu)化應(yīng)用于實際生產(chǎn)，精制大豆?jié)饪s磷脂不溶性雜質(zhì)含量為0.08%，多環(huán)芳烴含量為2.97 μg/kg，經(jīng)超臨界CO2萃取，得到臨界CO2萃取粉末磷脂，萃取率為83.76%。不溶性雜質(zhì)含量為0.06%，多環(huán)芳烴含量為2.45 μg/kg，HLB值可以達(dá)到8。

3 結(jié)論

通過添加正己烷除去大豆?jié)饪s磷脂的雜質(zhì)，并篩選出凹凸棒脫除多環(huán)芳烴效果最佳，通過超臨界CO2萃取試驗室研究，取得試驗數(shù)據(jù)，并通過產(chǎn)業(yè)化驗證取得良好效果。通過正己烷添加量為1.5 mL/g，凹凸棒添加量為5%，精制大豆?jié)饪s磷脂含雜質(zhì)量為0.05%，多環(huán)芳烴量為2.29 μg/kg。再經(jīng)超臨界CO2萃取粉末磷脂含雜質(zhì)量為0.03%，多環(huán)芳烴量為1.83 μg/kg。最后經(jīng)實際生產(chǎn)，超臨界CO2萃取粉末磷脂質(zhì)量為雜質(zhì)量為0.06%，多環(huán)芳烴量為2.45 μg/kg，HLB值可以達(dá)到8。不僅親水性有所提高，而且多環(huán)芳烴含量達(dá)到了美國出口的要求，并出口創(chuàng)匯。