兩步水解法制備玉米抗氧化活性肽及產(chǎn)物的穩(wěn)定性

王曉杰 劉曉蘭 曲 悅 夏春榮 Stanislav Sukhikh Anna Аndreyeva

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，齊齊哈爾 161006)(康德波羅的海聯(lián)邦大學(xué)生命系統(tǒng)研究所微生物學(xué)和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，加里寧格勒 236016)

玉米肽是玉米醇溶蛋白經(jīng)蛋白酶水解或微生物發(fā)酵后獲得的低分子量產(chǎn)物。與玉米醇溶蛋白相比，玉米肽的水溶性顯著增加，而且具有多重生物活性，包括抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶[1]、促進(jìn)乙醇代謝[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、抗癌[5]等，在食品工業(yè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

目前，在玉米抗氧化活性肽制備過(guò)程中，優(yōu)先選擇堿性蛋白酶Alcalase進(jìn)行酶解[6]，其添加量一般在1%～4%(酶底比)范圍內(nèi)[7-9]，有的甚至高達(dá)到9.13%[10]。由于商用酶制劑價(jià)格偏高，大大提高了玉米肽的生產(chǎn)成本，制約了玉米肽的工業(yè)化生產(chǎn)和產(chǎn)品推廣。

大麥芽由大麥經(jīng)浸泡、發(fā)芽和熱風(fēng)干燥(水分4%～5%)制成[11]。在大麥芽中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40多種內(nèi)切蛋白酶，包括四種常見的蛋白酶類型，分別是天冬氨酸類蛋白酶、半胱氨酸類蛋白酶、絲氨酸類蛋白酶和金屬類蛋白酶[12]。根據(jù)蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的催化部位，大麥芽中的蛋白酶可以分為內(nèi)肽酶、羧肽酶、氨肽酶、二肽酶等[13]。在啤酒釀造工業(yè)，這些蛋白酶可以消化大麥醇溶蛋白以及其他大麥蛋白以增加蛋白質(zhì)的溶解性；在中醫(yī)領(lǐng)域，作為助消化的輔助藥物而廣泛應(yīng)用。但是，還鮮有將麥芽粉作為蛋白酶制劑應(yīng)用于玉米肽的制備中。

為解決玉米肽制備過(guò)程中商業(yè)酶制劑用量偏高的問(wèn)題，本研究采用麥芽粉和堿性蛋白酶Alcalase對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行兩步水解，首先利用麥芽粉中蛋白酶的水解作用將玉米醇溶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，將埋藏在分子內(nèi)部的活性位點(diǎn)暴露出來(lái)，為第二步酶解創(chuàng)造有利條件，在保證酶解效率的同時(shí)，降低第二步商業(yè)酶制劑的使用量；研究玉米抗氧化活性肽的穩(wěn)定性，為玉米抗氧化活性肽的工業(yè)化生產(chǎn)及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白，自制麥芽粉。

堿性蛋白酶Alcalase(6.28 × 105U/mL)；硫代巴比妥酸、菲洛嗪；氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、2-脫氧-D-核糖、藍(lán)色葡聚糖2000、aprotinine、桿菌肽。

1.2 儀器與設(shè)備

PC/PLCLD-53真空冷凍干燥機(jī)，NDA 701全自動(dòng)凱氏定氮儀，TDL-5-A離心機(jī)，Purifier100蛋白質(zhì)純化色譜儀，DF-1集熱式磁力加熱攪拌器，Superdex Peptide 10/300 GL凝膠層析柱，pB-10 pH計(jì)，TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 麥芽粉的制備

用小型粉碎機(jī)在轉(zhuǎn)速16 000 r/min、時(shí)間10 s的條件下反復(fù)多次將大麥芽磨成粉末，磨粉過(guò)程時(shí)刻注意溫度的變化，防止溫度過(guò)高使蛋白酶變性。粉碎后過(guò)80目篩，得到麥芽粉，在干燥條件下保存。根據(jù)GB/T 28715—2012測(cè)定麥芽粉的蛋白酶總活力為(268.27±6.11)U/g。

1.3.2 玉米醇溶蛋白兩步酶解法條件的優(yōu)化

麥芽粉的第一步酶解：取10 g玉米醇溶蛋白放于250 mL燒杯中，加入蒸餾水配制成底物濃度10%的懸浮液，調(diào)節(jié)pH至5.5。按酶底比30%加入麥芽粉，攪拌均勻，加入大小合適的轉(zhuǎn)子后，將燒杯放入50 ℃水浴磁力攪拌器中央，開始第一步水解反應(yīng)。水解過(guò)程中通過(guò)滴加0.5 mol/L NaOH使pH維持在5.5，水解3 h后獲得第一步酶解液。

堿性蛋白酶Alcalase的第二步酶解：調(diào)節(jié)第一步酶解液pH至8.5，溫度至60 ℃，加入堿性蛋白酶Alcalase開始酶解反應(yīng)，酶解過(guò)程中通過(guò)不斷滴加0.5 mol/L NaOH使pH維持在8.5，在酶解0、0.5、1、1.5、2 h時(shí)分別取樣2 mL裝入離心管，放入沸水浴中滅酶5 min。4 000 r/min離心10 min后取上清液用于測(cè)定可溶性蛋白含量和抗氧化活性。

通過(guò)水解度、可溶性蛋白含量及抗氧化活性三個(gè)指標(biāo)的綜合比較，確定第二步Alcalase酶解的最適酶底比、底物濃度和水解時(shí)間。三個(gè)因素的實(shí)驗(yàn)范圍為：酶底比：0.5%、0.75%、1.0%；底物濃度：7.5%、10%、12.5%；水解時(shí)間：1、2、3、4、5、6、7、8 h。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

可溶性蛋白含量采用Folin-酚法測(cè)定[14]，總蛋白含量采用微量凱氏定氮法測(cè)定。

1.3.4 水解度的測(cè)定

采用pH-stat法[15]。

1.3.5 抗氧化活性的測(cè)定

檢測(cè)指標(biāo)包括羥基自由基清除活性和亞鐵離子螯合能力，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[16]。

1.3.6 分子質(zhì)量分布的測(cè)定

將樣品溶解在含有0.15 mol/L NaCl的pH 7.0的磷酸鹽(PBS，0.02 mol/L)緩沖液中，配置成蛋白質(zhì)濃度為2 mg/mL的溶液。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾。上樣體積100 μL，流速0.25 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。色譜柱用含有0.15 mol/L NaCl的pH 7.0的PBS(0.02 mol/L)緩沖液進(jìn)行平衡和洗脫。色譜柱用藍(lán)色葡聚糖2000測(cè)定外水體積，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白(aprotinine，6 500 u；桿菌肽，1 400 u；氧化型谷胱甘肽，612 u；還原型谷胱甘肽，307 u)進(jìn)行校正。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量對(duì)數(shù)lgMr與有效分配系數(shù)Kaw的線性回歸方程為y=-3.734 7x+4.815 3，R2=0.982。

1.3.7 玉米抗氧化活性肽穩(wěn)定性的研究

考察pH、溫度和凍融次數(shù)對(duì)玉米抗氧化活性肽穩(wěn)定性的影響。用pH分別為3、5、7、9、11的緩沖液將樣品配制成蛋白質(zhì)濃度為2 mg/mL的溶液，在25 ℃下保溫60 min后測(cè)定羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率，表征pH對(duì)玉米抗氧化活性肽穩(wěn)定性的影響。

將樣品配制成10 mL、2 mg/mL的溶液，分別在4、25、37、100 ℃下放置2 h，通過(guò)測(cè)定羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率，表征玉米抗氧化活性肽的熱穩(wěn)定性。

將樣品配制成10 mL、2 mg/mL的溶液，測(cè)定-20 ℃冷凍24 h，25 ℃解凍1 h(反復(fù)凍融0、1、2、3、4、5次)時(shí)玉米肽的羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率，表征玉米抗氧化活性肽的貯藏穩(wěn)定性。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行3次，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS Statistics 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米醇溶蛋白兩步酶解法的條件優(yōu)化

2.1.1 最適酶底比的確定

第一步采用麥芽粉水解3 h，不滅酶直接加入堿性蛋白酶Alcalase進(jìn)行第二步酶解，在反應(yīng)初始pH 8.5、溫度60 ℃、底物濃度10%、時(shí)間2 h的條件下，研究不同酶底比對(duì)水解度、可溶性蛋白含量及產(chǎn)物抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖1所示。在麥芽粉酶解3 h基礎(chǔ)上，加入Alcalase繼續(xù)酶解，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)和加酶量的增加，水解度和可溶性蛋白含量逐漸增大。這是因?yàn)樵诘孜餄舛纫欢ǖ臈l件下，酶促反應(yīng)速率和酶濃度成正比，隨著酶添加量增加，水解速率加快，水不溶性的玉米醇溶蛋白在蛋白酶的作用下逐漸被切割成小分子肽段，使可溶性蛋白含量增加。但當(dāng)酶底比由0.75%增加至1%時(shí)，水解度和可溶性蛋白含量之間差異不顯著(P>0.05)，可能是因?yàn)楫?dāng)酶底比超過(guò)0.75%時(shí)，酶相對(duì)過(guò)量，引起了底物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制[17]，阻礙了酶與底物的結(jié)合。

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，余同。

酶底比0.75%制備的玉米肽具有更高的抗氧化活性，可能是因?yàn)椴煌用噶坑绊懥怂猱a(chǎn)物中的肽段長(zhǎng)度及結(jié)構(gòu)[18]，進(jìn)而影響了玉米肽的抗氧化活性。在酶底比1%時(shí)，玉米醇溶蛋白酶解效率高，隨著水解度的增大，具有抗氧化活性的多肽繼續(xù)水解為無(wú)抗氧化活性的短肽或游離氨基酸，導(dǎo)致清除羥基自由基和螯合亞鐵離子的能力降低。而酶底比為0.5%時(shí)，由于酶解效率低，導(dǎo)致具有抗氧化活性的玉米肽產(chǎn)量較少。兩步水解法是為了利用麥芽粉的初步消解作為而降低Alcalase的使用量，同時(shí)制備出高抗氧化活性的玉米肽，因此，確定Alcalase的最適酶底比為0.75%。

2.1.2 最適底物濃度的確定

第一步采用麥芽粉水解3 h，不滅酶直接加入堿性蛋白酶Alcalase進(jìn)行第二步酶解，在反應(yīng)初始pH 8.5、溫度60 ℃、酶底比0.75%、時(shí)間2 h的條件下，研究不同底物濃度對(duì)水解度、可溶性蛋白含量及產(chǎn)物抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖2所示。在不同底物濃度條件下，玉米醇溶蛋白的水解度之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但對(duì)可溶性蛋白含量和抗氧化活性影響較大。在整個(gè)水解期間內(nèi)，當(dāng)?shù)孜餄舛扔?.5%增加至10%時(shí)，可溶性蛋白含量、羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率均增大，但是繼續(xù)增加底物濃度，可溶性蛋白含量和抗氧化活性均降低。底物濃度低于10%時(shí)，可溶性蛋白含量的提高可歸因于Alcalase對(duì)底物的有效消化，從而產(chǎn)生更多具有抗氧化活性的玉米肽。但隨著底物濃度的繼續(xù)增加，底物和酶的擴(kuò)散率均降低[19]，且底物相對(duì)過(guò)量，Alcalase無(wú)法完全消化底物，導(dǎo)致玉米醇溶蛋白消化效率降低，抗氧化活性玉米肽的生成量減少，抗氧化活性降低。因此，選擇最適的底物濃度為10%。

圖2 底物濃度對(duì)玉米醇溶蛋白酶解效率及產(chǎn)物抗氧化活性的影響

2.1.3 最適水解時(shí)間的確定

第一步采用麥芽粉水解3 h，不滅酶直接加入堿性蛋白酶Alcalase進(jìn)行第二步酶解，在反應(yīng)初始pH8.5、溫度60 ℃、酶底比0.75%、底物濃度10%的條件下，研究水解時(shí)間對(duì)水解度、可溶性蛋白含量及產(chǎn)物抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度和可溶性蛋白含量均呈逐漸增加的趨勢(shì)。第一步酶解時(shí)，麥芽粉中蛋白酶的水解作用可以將玉米醇溶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，降低底物空間位阻的同時(shí)，將埋藏在分子內(nèi)部的Alcalase的催化位點(diǎn)暴露出來(lái)。加入Alcalase進(jìn)行第二步酶解時(shí)，由于加酶量低，所以酶切速度較慢，酶切反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，水解度持續(xù)增加，產(chǎn)生了更多的可溶性蛋白。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率均呈先升高后降低的趨勢(shì)。玉米肽的抗氧化活性與其肽段長(zhǎng)度、構(gòu)象以及氨基酸組成等因素有關(guān)[16]，隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，Alcalase持續(xù)水解，影響了水解產(chǎn)物中肽段的氨基酸組成和構(gòu)象，進(jìn)而影響了玉米肽的抗氧化活性。

圖3 水解時(shí)間對(duì)玉米醇溶蛋白酶解效率及產(chǎn)物抗氧化活性的影響

綜合分析，確定Alcalase的最適水解時(shí)間為6 h。在此條件下，水解度、可溶性蛋白含量、羥基自由基清除率及亞鐵離子螯合率分別為24.53%、33.43 mg/mL、30.59%、38.32%。此時(shí)的水解度和可溶性蛋白含量與Jin等[7]采用Alcalase(2%)水解玉米蛋白粉75 min的效果相當(dāng)。

2.2 玉米醇溶蛋白水解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的測(cè)定

食物和動(dòng)物來(lái)源的抗氧化活性肽通常含有2～30個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為500～1 800 u，該范圍內(nèi)的肽通常具有較高的抗氧化活性，而且容易被人體消化吸收[20,21]。將樣品配制成2 mg/mL的溶液，測(cè)定在麥芽粉水解3 h基礎(chǔ)上，堿性蛋白酶Alcalase繼續(xù)水解2、4、6 h時(shí)水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，洗脫圖譜見圖4～圖6。

圖4 麥芽粉水解3 h+Alcalase水解2 h時(shí)樣品的凝膠層析洗脫圖譜

圖5 麥芽粉水解3 h+Alcalase水解6 h時(shí)樣品的凝膠層析洗脫圖譜

由圖4可以看出，在麥芽粉水解3 h基礎(chǔ)上，加入Alcalase繼續(xù)水解2 h，水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量主要分布在6 500～840 u和840～300 u范圍內(nèi)。隨著Alcalase水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解產(chǎn)物的洗脫圖譜逐漸向右移動(dòng)，分子質(zhì)量逐漸變小。在Alcalase繼續(xù)水解4 h時(shí)，分子質(zhì)量6 500～882 u組分的含量減少了5.18%，而分子質(zhì)量<300 u組分的含量增加了5.29%，可能是在麥芽粉中存在的羧肽酶和氨肽酶等催化下，導(dǎo)致水解產(chǎn)物中游離氨基酸含量增加；在Alcalase繼續(xù)水解6 h時(shí)，水解產(chǎn)物的分子量主要分布在300～6 500 u范圍內(nèi)。從分子質(zhì)量分布角度看，在麥芽粉的基礎(chǔ)上，Alcalase繼續(xù)水解，將玉米醇溶蛋白酶解成低分子量的肽段，也證明兩步酶解效果更顯著。另外，麥芽粉中存在的羧肽酶和氨肽酶，還可以將玉米肽鏈末端的疏水性氨基酸水解掉，進(jìn)而降低玉米肽的苦味，這還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

2.3 玉米抗氧化活性肽穩(wěn)定性的研究

2.3.1 pH對(duì)玉米抗氧化活性肽穩(wěn)定性的影響

將玉米肽溶解在不同pH緩沖液中，研究不同pH對(duì)玉米肽羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率的影響，以表征玉米抗氧化活性肽的酸堿穩(wěn)定性，結(jié)果見圖6。與對(duì)照相比，pH對(duì)玉米肽的羥基自由基清除能力沒(méi)有顯著性影響(P>0.05)，而對(duì)亞鐵離子螯合能力產(chǎn)生極顯著性影響(P<0.01)。在pH 3～5的條件下，玉米肽不具有亞鐵離子螯合能力；在pH 7時(shí)，螯合能力與對(duì)照相當(dāng)；在堿性環(huán)境中(pH>9)螯合能力極顯著增加(P<0.01)，尤其是pH 11時(shí)，螯合能力達(dá)到64.48%。蛋白質(zhì)和肽的金屬螯合能力可以通過(guò)與帶電荷氨基酸殘基之間的靜電相互作用完成[22]。隨著pH值的變化，溶劑介質(zhì)中的氫離子濃度發(fā)生變化，影響了玉米肽的帶電荷性質(zhì)，進(jìn)而影響了玉米肽的亞鐵離子螯合能力。因此，將玉米抗氧化肽應(yīng)用于食品工業(yè)時(shí)，應(yīng)該選擇保持其高抗氧化活性的制備條件，可以制備成弱堿性食品。

圖6 不同pH對(duì)玉米肽抗氧化活性的影響

2.3.2 溫度對(duì)玉米抗氧化活性肽穩(wěn)定性的影響

在濃度為2 mg/mL，pH為9.0的條件下，研究不同溫度對(duì)玉米肽抗氧化活性的影響，以表征玉米肽的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如表1所示。與25 ℃相比，4 ℃不能破壞玉米肽的抗氧化活性，而37、100 ℃對(duì)玉米肽的抗氧化活性起促進(jìn)作用，說(shuō)明玉米肽的抗氧化活性具有一定熱穩(wěn)定性，這與前人報(bào)道相一致[23]。可能是因?yàn)橛衩卓寡趸牡目臻g結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，主要具有肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)及少量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，高溫處理沒(méi)有導(dǎo)致肽鏈斷裂，僅使肽鏈部分二級(jí)結(jié)構(gòu)展開，暴露一些活性位點(diǎn)于分子表面，從而使玉米肽的抗氧化活性增大。因此，在食品工業(yè)中，玉米抗氧化活性肽可以耐受一定時(shí)間的高溫處理。

表1 處理溫度對(duì)玉米肽抗氧化活性的影響

2.3.3 凍融次數(shù)對(duì)玉米抗氧化活性肽穩(wěn)定性的影響

在質(zhì)量濃度為2 mg/mL，pH為9.0的條件下，研究不同凍融次數(shù)對(duì)玉米肽抗氧化活性的影響，以表征玉米抗氧化活性肽的貯藏穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7所示。與對(duì)照相比，隨著凍融次數(shù)的增加，玉米肽的羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率均呈現(xiàn)出穩(wěn)定狀態(tài)，說(shuō)明玉米抗氧化活性肽具有良好的貯藏穩(wěn)定性?？赡苁且?yàn)橛衩卓寡趸钚噪牡目臻g結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)采用的反復(fù)凍融條件對(duì)肽的氨基酸組成和構(gòu)象沒(méi)有影響，進(jìn)而玉米肽的抗氧化活性沒(méi)有受到損失。

圖7 凍融次數(shù)對(duì)玉米肽抗氧化活性的影響

3 結(jié)論

采用蛋白酶酶系豐富的麥芽粉和酶解效率較高的堿性蛋白酶Alcalase對(duì)玉米醇溶蛋白進(jìn)行兩步水解，確定了兩步水解法制備高抗氧化活性玉米肽的最適條件為：第一步麥芽粉水解，在底物濃度10%、pH 5.5、溫度50 ℃、酶底比30%條件下水解3 h；第二步Alcalase酶解，在底物濃度10%、pH 8.5、溫度60 ℃、酶底比 0.75%條件下水解6 h。同時(shí)，玉米抗氧化活性肽具有熱及貯藏穩(wěn)定性，在中性和堿性條件下穩(wěn)定，但不耐受酸性條件。兩步水解法既降低了商品用酶制劑的用量，又保證了產(chǎn)物的抗氧化活性，為制備高抗氧化活性玉米肽及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了參考。