紫紅曲菌發(fā)酵薏米促α-生育酚富集及其發(fā)酵動力學(xué)模型構(gòu)建

宋增光 曾海英 秦禮康 朱 怡 毛佳怡

(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院1，貴陽 550025)(貴州省植保植檢站2，貴陽 550001)

紫紅曲菌(Monascuspurpureus)是一種小型絲狀腐生真菌，屬紅曲科(Monascaceae)、紅曲霉屬(Monascus)[1]是生產(chǎn)紅曲的特征性微生物。由紅曲霉菌發(fā)酵谷物糧食所得的紅曲是我國傳統(tǒng)的藥食兩用食物。紫紅曲菌發(fā)酵過程中會產(chǎn)生多種有益的次級代謝產(chǎn)物，富含生育酚、谷維素、Monacolin K、γ-氨基丁酸、麥角固醇、天然植物激素等活性成分[2-4]，具有降脂、降壓、抗氧化和調(diào)節(jié)機(jī)體代謝等功效[5,6]。

薏米是一種藥食兩用的雜糧，含大量營養(yǎng)成分，如多糖、薏苡素、薏苡酯、脂肪酸、多不飽和脂肪酸及多種氨基酸等。據(jù)報(bào)道薏米及其提取物具有抗氧化、抗癌、抑制肥胖、降血糖、抗炎等功效[7]。還具有降脂降糖、抗癌、抗氧化、抗過敏、提高免疫力等生理活性功能[8,9]。

Huang等[10]利用紫紅曲菌固態(tài)發(fā)酵葛根和紅曲米的混合基質(zhì)，發(fā)酵后的異黃酮含量和色素強(qiáng)度均高于紅曲米和葛根，且發(fā)酵混合物的DPPH、·OH、FRAP和總抗氧化活性也比葛根和紅曲米具有更高的抗氧化能力，主要是由于發(fā)酵之后的色素強(qiáng)度和總酚的含量增加的原因。賀圣凌等[2]對紅曲發(fā)酵薏苡糠親脂化合物量變規(guī)律進(jìn)行了探究，結(jié)果表明紅曲發(fā)酵薏苡糠其親脂性化合物主要為α-生育酚和γ-谷維素，且在發(fā)酵過程中，兩者含量均明顯增加。楊玉潔等[11]用紅曲霉菌發(fā)酵不同雜糧優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)親脂性化合物γ-谷維素含量比未發(fā)酵的增加了14倍。

本實(shí)驗(yàn)以薏米為發(fā)酵底物，以紫紅曲菌(Monascuspurpureus3.4629)作為發(fā)酵菌種，以α-生育酚含量為評價指標(biāo)，采用固態(tài)發(fā)酵工藝技術(shù)[12]，利用響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件，并通過建立發(fā)酵動力學(xué)模型研究紫紅曲菌固態(tài)發(fā)酵薏米產(chǎn)α-生育酚過程中菌體、產(chǎn)物、底物之間的動態(tài)定量關(guān)系，更準(zhǔn)確地對參數(shù)進(jìn)行預(yù)測[13]。通過利用實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)大規(guī)模的發(fā)酵工藝過程[14]，為天然α-生育酚的富集提供新思路、新方法和新工藝，同時充分挖掘薏米資源的綜合利用價值，提高其經(jīng)濟(jì)附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米；紫紅曲菌(Monascuspurpureus3.4629):中國普通微生物菌種保藏管理中心。

正己烷(色譜純);α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%);其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器,HH-B11·600BY電熱恒溫培養(yǎng)箱,TCL-16B高速臺式離心機(jī),安捷倫1260高效液相色譜。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵方法

1.3.1.1 紫紅曲菌孢子懸浮液的制備

制備方法參考楊玉潔等[11]方法，并做適當(dāng)改進(jìn)。

1.3.1.2 紫紅曲菌種子液的制備

制備方法和發(fā)酵方法參考楊玉潔等[11]方法，并做適當(dāng)改進(jìn)。

1.3.2 生物量測定

菌體量測定[15]: 固態(tài)發(fā)酵時菌絲和基質(zhì)纏織在一起，直接計(jì)量生物量非常困難，一般通過間接法計(jì)量。由于氨基葡萄糖是參與構(gòu)成真菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的主要成分，因此用氨基葡萄糖含量可以表征菌體量。

1.3.3 薏米紫紅曲菌固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.3.1 薏米紫紅曲菌發(fā)酵工藝條件的單因素實(shí)驗(yàn)

以薏米為發(fā)酵底物，分別固定料液比(2∶1)、接種量10%、發(fā)酵時間10 d，發(fā)酵溫度30 ℃。分別考察其料液比、接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度等單因素對薏仁紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)α-生育酚的影響，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際情況，選出對α-生育酚含量影響顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 薏米紫紅曲菌發(fā)酵工藝的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

綜合發(fā)酵過程中各單因素對α-生育酚含量影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[16]，選擇對α-生育酚含量有顯著影響的3個因素發(fā)酵溫度(A)、接種量(B)、料液比(C)為自變量，以α-生育酚含量(Y)為響應(yīng)變量，利用Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3.4 分析檢測

樣品處理:發(fā)酵成熟雜糧基質(zhì)冷凍干燥打粉后精確稱取發(fā)酵物2 g，加入5 mL 色譜純正己烷，振蕩混勻，于60 ℃水浴鍋中水浴20 min，8 000 r/min離心15 min，吸取上清液，如此采用正己烷反復(fù)提取3次，合并上清液層，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干提取液，揮干物中加入1 mL 正己烷，超聲使之溶解完全，8 000 r/min離心10 min，吸取上清液，過0.22 μm濾膜，入進(jìn)樣瓶。

色譜條件:色譜柱:硅膠柱(SUPELCOSILTM LC-SI)，25 cm×4.6 mm，5 μm。流動相:0.8%乙酸乙酯與 0.8%醋酸溶于正己烷。流速:1.5 mL/min。柱溫:22 ℃。檢測波長:290 nm。進(jìn)樣量:40 μL。

根據(jù)色譜條件對發(fā)酵薏米樣品處理液進(jìn)行HPLC上樣分析，利用保留時間和光譜特征峰作為定性依據(jù)，采取峰面積歸一法計(jì)算各組成的含量即外標(biāo)法定量。

1.3.5 動力學(xué)模型建立

根據(jù)篩選得到的最佳發(fā)酵條件，建立紫紅曲菌發(fā)酵薏米的菌體生長、產(chǎn)物生成和底物消耗動力學(xué)模型，利用紫紅曲菌發(fā)酵薏米，每隔 2 d測定其生物量、α-生育酚含量及總糖消耗量，計(jì)算出動力學(xué)模型的參數(shù)，建立動力學(xué)方程，預(yù)測其在發(fā)酵過程中的變化。

1.3.5.1 菌體生長動力學(xué)模型的建立

發(fā)酵動力學(xué)的核心是關(guān)于菌體生長的動力學(xué)，生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中描述在資源有限條件下種群增長規(guī)律的最佳數(shù)學(xué)模型是Logistic方程[17]。因此，Logistic方程[18]適合真菌的固態(tài)培養(yǎng)過程，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為:

(1)

以t=0，X=Xm為初始條件，將式(1)積分變形后得式(2)，即:

(2)

式中:X0為菌體的初始生物量，以氨基葡萄糖量表征/OD/g；Xm為菌體的最大生物量/OD/g；μm為最大比生長速率/d-1；t為時間/d。

1.3.5.2 產(chǎn)物生成動力學(xué)模型的建立

產(chǎn)物生成速率與細(xì)胞生長速率之間的關(guān)系有三種類型:產(chǎn)物生成與菌體生長偶聯(lián)型、產(chǎn)物生成與菌體生長部分偶聯(lián)型及產(chǎn)物生成與菌體生長非偶聯(lián)型[19,20]。紫紅曲菌菌體生長與α-生育酚合成之間的關(guān)系為部分偶聯(lián)型，因此，選擇Leudeking-piret方程[21]作為合成動力學(xué)模型，見式(3)。

(3)

式中:P為產(chǎn)物濃度/mg/mL；X為生物量/OD/g；t為時間/d；a為與菌體生長相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù)；b為與菌體量相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)物合成常數(shù)。

將式(1)代入式(3)再積分得到式(4)。

P(t)=P0+c[X(t)-X0]+

(4)

1.3.5.3 底物消耗動力學(xué)模型建立

在發(fā)酵過程中，底物消耗主要有三個方面:菌體生長、細(xì)胞維持生命活動的消耗及生成代謝產(chǎn)物的消耗[22]。從發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，底物消耗主要用于菌體生長和維持細(xì)胞代謝活動[23]。底物消耗動力學(xué)模型使用Dose Resp方程進(jìn)行擬合[24,25]，模型見式(5)。

(5)

式中：S為底物濃度/g/mL；YX/S為菌體得率系數(shù)；YP/S為產(chǎn)物產(chǎn)率系數(shù)；Ke為維持系數(shù)。在紫紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-生育酚的過程中，底物不用于菌體的生長消耗，僅用于產(chǎn)物的合成，因此，為簡化模型，式(5)可簡化為:

(6)

S(t)=S(0)+gP(t)

(7)

再將式(4)代入式(7)中可得到底物消耗動力學(xué)擬合方程，見式(8):

(8)

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，采用Origin 8作圖，SPSS Statistics 17.0單因素差異性分析鄧肯檢驗(yàn)、Design-Expert 7.0.0響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薏米紫紅曲菌發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵條件對α-生育酚含量的影響

由圖1可知，α-生育酚含量隨著發(fā)酵溫度的變化呈先上升后下降的趨勢。發(fā)酵溫度為30 ℃時，菌體生長良好，α-生育酚含量最高，基質(zhì)顏色呈紫紅色，α-生育酚含量顯著高于其他組(P<0.05)。

圖1可知，當(dāng)料液比為2∶1時，菌體生長良好，紅曲顏色呈深紅色，此時α-生育酚含量最高。料液比過高發(fā)酵熱使得基質(zhì)水分的散失，菌體的生長代謝受到限制，過低基質(zhì)透氣性不佳，紅曲菌生長受阻，出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象。

接種量大小會影響菌體在培養(yǎng)基中的適應(yīng)能力從而影響生長速度。適宜的接種量有利于微生物的生長代謝，有利于菌體的增長和次級代謝產(chǎn)物的積累。由圖1可知，當(dāng)接種量為10%時，α-生育酚含量最高，顯著高于其他組(P<0.05)。

注:顯著性分析字母加粗為溫度，下劃線為接種量，斜體為料液比。

2.1.2α-生育酚最佳收獲期

由圖2可以看出，α-生育酚含量隨著發(fā)酵時間的延長呈先升高后平穩(wěn)的趨勢，第10天時達(dá)到最高(P<0.05)，10 d后α-生育酚的含量開始呈緩慢的下降趨勢。梁爽等[26]利用紅曲霉菌發(fā)酵秈米，確定收曲時間為9 d，此時桔霉素含量處于較高水平，糖化酶活力，色價均達(dá)到最高值。蒲立檸等[27]用紫紅曲菌發(fā)酵青稞麩皮薏米基質(zhì)時發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物的最佳收獲期為12 d左右。發(fā)酵時間越長，基質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，大量菌體生長受到抑制或死亡，可能出現(xiàn)惡性厭氧發(fā)酵，使α-生育酚結(jié)構(gòu)受到破壞，產(chǎn)量下降。綜合考慮，發(fā)酵時間為10 d左右為宜。

圖2 α-生育酚最佳收獲期

2.2 薏米紫紅曲菌發(fā)酵條件的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇對α-生育酚含量影響較大的因素:發(fā)酵溫度(A)、接種量(B)、料液比(C)為自變量，固定發(fā)酵時間10 d，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，各因素的實(shí)驗(yàn)組合及結(jié)果見表2。

由表2可看出優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果α-生育酚的產(chǎn)量較優(yōu)化前顯著增加，0水平和1水平對α-生育酚的產(chǎn)量有促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)號5、7、10、15四組0水平條件下α-生育酚產(chǎn)量差異不大，誤差較小。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

利用Design-Expert 7.0.0軟件對表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到二次回歸模型方差分析結(jié)果見表3。對表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到α-生育酚含量(Y)對發(fā)酵溫度(A)、接種量(B)、料液比(C)的二次多項(xiàng)式回歸方程如下:

Y=12.61+1.99A+2.06B-2.19C-0.25AB+0.24AC-0.15BC-3.03A2-2.89B2-3.06C2

由表3回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知:模型的一次項(xiàng)A、B、C影響極顯著(P<0.01)。二次項(xiàng)A2、B2、C2影響極顯著(P<0.01)，交互項(xiàng)AB、BC、AC影響不顯著，表明溫度、接種量、料液比對α-生育酚含量交互影響作用不顯著。

表3 二次回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

根據(jù)Design-Expert 8軟件響應(yīng)面分析，可從回歸模型中得到最優(yōu)工藝條件:料液比2∶1、接種量15%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間10 d。在該優(yōu)化條件下，α-生育酚含量的理論值為12.413 6 mg/mL，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出α-生育酚含量達(dá)12.067 mg/mL，與預(yù)測值接近，說明響應(yīng)面法對紫紅曲菌發(fā)酵薏米工藝條件的優(yōu)化是可行的。

2.3 紫紅曲菌發(fā)酵薏米動力學(xué)擬合結(jié)果

2.3.1 紫紅曲菌固態(tài)發(fā)酵薏米動力學(xué)曲線

紫紅曲菌固態(tài)發(fā)酵薏米，發(fā)酵過程測定總糖含量、生物量(氨基葡萄糖含量表征)和α-生育酚的含量，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯鲎霞t曲菌生長和α-生育酚合成均呈S型曲線，在接種后紫紅曲菌生長有一段2 d的適應(yīng)期，菌體量增長緩慢，α-生育酚的合成緩慢，總糖消耗加速，之后進(jìn)入快速增長期，在8～10 d進(jìn)入穩(wěn)定期，10 d時菌體量和α-生育酚的含量都達(dá)到最大值，紫紅曲菌已長滿整個薏米培養(yǎng)基，且顏色呈紫紅色，此后進(jìn)入衰亡期，菌體生長，產(chǎn)物富集開始緩慢減少，總糖消耗趨于完全。

圖3 紫紅曲霉生長和α-生育酚合成曲線圖

2.3.2 菌體生長動力模型擬合結(jié)果

在軟件 Origin 8.6 中輸入式(2)的自定義函數(shù)，對菌體生物量的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算各參數(shù)的值從而得到動力學(xué)方程。由實(shí)驗(yàn)值得到Xm=0.55 OD/g，經(jīng)擬合可得X0(a)=0.051 OD/g，μm(b)=0.578 9 d-1，代入式(2)中得到菌體生長動力學(xué)方程為:

R2=0.954 2

圖4 菌體生長動力學(xué)模型擬合曲線

2.3.3 產(chǎn)物生成動力模型擬合結(jié)果

利用 Origin8.6 軟件建立式(8)的自定義函數(shù)，對產(chǎn)物含量的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算各參數(shù)的值從而得到動力學(xué)方程.可得P0(e)=-0.577 7 mg/L，c=15.812 6，d=1.017，代入式(8)中得到產(chǎn)物合成動力學(xué)方程為:

R2=0.949

圖5 產(chǎn)物生成動力學(xué)模型擬合曲線

2.3.4 底物消耗動力學(xué)模型擬合結(jié)果

利用 Origin8.6 軟件建立式(8)的自定義函數(shù)，對底物含量的實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算各參數(shù)的值從而得到動力學(xué)方程。可得f=3.6，g=-0.38代入式(8)中得到總糖消耗動力學(xué)方程為:

R2=0.125

圖6 底物消耗動力學(xué)模型擬合曲線

根據(jù)動力學(xué)模型擬合結(jié)果可以看出:紫紅曲菌發(fā)酵薏米動力學(xué)實(shí)驗(yàn)值與模型擬合值較為吻合，R2擬合度良好，模型極顯著，能準(zhǔn)確反映紫紅曲菌發(fā)酵薏米過程中菌體生長、產(chǎn)物合成以及底物消耗的動態(tài)變化規(guī)律。目前紫紅曲菌固態(tài)發(fā)酵動力學(xué)研究甚少，通過發(fā)酵動力學(xué)模型可以看出α-生育酚的合成為生長部分偶聯(lián)型，生物量與產(chǎn)物合成成正比，菌體生長動力學(xué)確定紫紅曲菌發(fā)酵薏米的生長快速增長期為4～8 d。利用快速增長期，不斷補(bǔ)充底物延長快速增長期使之實(shí)現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵，或者利用快速增長期4～6 d的菌體制作種子，縮短適應(yīng)期達(dá)到縮短生產(chǎn)周期，進(jìn)一步促進(jìn)產(chǎn)物的富集，對于工業(yè)化生產(chǎn)具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

以紫紅曲菌發(fā)酵薏米基質(zhì)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出紫紅曲菌固態(tài)發(fā)酵薏米產(chǎn)α-生育酚的最佳條件為料液比2∶1、接種量15 %、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間10 d，此條件下α-生育酚含量最高，為12.413 6 mg/mL，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出α-生育酚含量達(dá)12.067 mg/mL，與預(yù)測值接近，優(yōu)化可行。通過建立菌體生長動力學(xué)、產(chǎn)物生成動力學(xué)和總糖消耗動力學(xué)模型，模擬發(fā)酵過程中菌體、產(chǎn)物、底物之間的相互關(guān)系和動態(tài)變化過程，發(fā)酵動力學(xué)模型的預(yù)測值和實(shí)測值擬合效果良好，所建模型能較好反映紫紅曲菌發(fā)酵薏米過程中的動力學(xué)變化。