miR?29c在神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理研究進展

魯瑩 李勃 謝曄 萬琪 曾俊偉

遵義醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室（貴州遵義563000）

微小RNA（miRNAs）是一類保守、內(nèi)源性的小的非編碼RNA（20 ～ 22 個核苷酸），通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)（3′?UTR）特異性結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯阻滯，影響關(guān)鍵蛋白合成，從而調(diào)控細胞的增殖、凋亡與分化等生物學(xué)行為。近年文獻報道m(xù)iR?29c 在神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達，且通過作用不同的靶基因，影響各種信號通路，參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如膠質(zhì)瘤、神經(jīng)退行性疾病和腦損傷等發(fā)生發(fā)展。本文圍繞miR?29c 與神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理相關(guān)研究進展進行綜述，以期為臨床治療提供潛在的藥物靶點與新思路。

1 miR?29c 結(jié)構(gòu)與表達調(diào)控

成熟的miR?29 家族主要包括miR?29a、miR?29b 和miR?29c 三種miRNAs。生物信息學(xué)分析顯示miR?29 家族成員由不同的前體加工而成，但不同成員間預(yù)測的靶基因高度重疊。miR?29c 的基因序列位于染色體1q23，基因轉(zhuǎn)錄后生成的miR?29c前體序列5′端的成熟序列為5′?UGACCGAUUU?CUCCUGGUGUUC?3′，3′端的成熟序列為5′?UAG?CACCAUUUGAAAUCGGUUA?3′。有多種轉(zhuǎn)錄因子通過與miR?29c 基因啟動子中的特異性位點結(jié)合并促進其轉(zhuǎn)錄，如缺氧誘導(dǎo)因子α（hypoxia?in?ducible factor?α，HIF?α），YAP 和PU.1 等。HIF?α和YAP 的結(jié)合位點分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 300 bp 和150 ～ 300 bp［1-2］。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNA methyltransferase 3a，DNMT3a）和DNMT3b 可使miR?29c 啟動子高甲基化進而抑制其轉(zhuǎn)錄使表達下降；同時，組蛋白去乙?；?（histone deacet?ylase 3，HDAC3）和Zeste 同源物增強子2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）與c?Myc 可組成共抑制復(fù)合體結(jié)合至miR?29 啟動子上抑制其表達［3］。此外長鏈非編碼RNA（lncRNA），如長鏈非編碼XIST 可作為分子海綿，抑制miR?29c 的表達［4］。

2 miR?29c 在神經(jīng)系統(tǒng)表達

miR?29 家族作為重要的基因表達調(diào)控因子，在多種疾病中發(fā)揮著重要作用。其中miR?29c 在心臟、肝臟、子宮以及肌肉中的表達較低，在大腦和脊髓中的表達水平較高［5］，且主要表達于前額葉皮層、海馬、伏隔核、中腦黑質(zhì)致密部、小腦頂核以及脊髓背角等部位［6-10］。此外miR?29c 也表達于背根神經(jīng)節(jié)和視網(wǎng)膜等部位［11-12］。進一步形態(tài)學(xué)試驗觀察到miR?29c 表達于大鼠海馬神經(jīng)元以及體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞、小鼠黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元和背根節(jié)的神經(jīng)元細胞［9，11，13］。而且在SH?SY5Y 人神經(jīng)母細胞瘤細胞系、U251 人膠質(zhì)瘤細胞系、BV?2 小鼠小膠質(zhì)細胞系、PC12 和HT22 小鼠海馬神經(jīng)元細胞系中也可見miR?29c 表達［7，14-16］。這些有關(guān)miR?29c 的形態(tài)學(xué)研究為深入探討miR?29c 在神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能及其參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)機制奠定了基礎(chǔ)。

3 miR?29c 參與神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能調(diào)節(jié)

3.1 miR?29c 與神經(jīng)發(fā)育ZOU 等［14］在動物試驗中觀察到隨著大腦的發(fā)育，miR?29c 的表達也在動態(tài)變化中；在胚胎期第15 天小鼠大腦miR?29c 表達較低，但在新生第3、5 天大腦miR?29c 表達上升10 倍左右，到新生第7 天小鼠大腦miR?29c 表達雖有所下降但仍遠高于胚胎期。同時PODOLSKA等［17］研究顯示，與胚胎期第50 天家豬相比，在成年家豬的大腦皮質(zhì)和小腦miR?29c 的表達分別增加了22 倍和18 倍。XIA 等［12］研究發(fā)現(xiàn)在視網(wǎng)膜祖細胞分化過程中，與未分化期相比，中分化期與分化期的miR?29c 表達變化也逐漸增加。miR?29c 作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)發(fā)育不同階段調(diào)控多種基因在特定的時間與空間順序中表達，但其具體機制還需未來探索。

3.2 miR?29c 維持神經(jīng)元生長在神經(jīng)生長因子（NGF）誘導(dǎo)PC12 細胞分化的過程中，張力蛋白同源物基因（PTEN）能夠抑制神經(jīng)元突起的生長并影響其形態(tài)；而當PC12 細胞過表達miR?29c，可作用于PTEN 的3′?UTR 使其表達明顯下降，AKT 磷酸化水平上升，軸突膜蛋白標記物生長相關(guān)蛋白43（GAP?43）表達增加，神經(jīng)絲蛋白200（NF?200）和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）表達均上升，這有利于神經(jīng)元存活和突起形成生長［14］。

3.3 miR?29c 通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性促進認知功能腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）表達于大腦皮層、海馬等多個腦區(qū)，對維持神經(jīng)元突觸可塑性具有重要作用。在大鼠海馬神經(jīng)元，miR?29c 作用于DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3（DNMT3）的3′?UTR 并抑制其表達，致使BDNF 基因啟動子甲基化程度降低從而表達上調(diào)，TrkB/Erk 通路激活，促進神經(jīng)元生長相關(guān)蛋白?43（GAP?43）的表達，對于神經(jīng)元存活和突觸可塑性的維持具有重要作用。在小鼠海馬CA1區(qū)，BDNF 表達增加促進了GAP?43 磷酸化，誘導(dǎo)神經(jīng)元興奮性突觸后電位（EPSP）幅值增大，引起長時程增強（LTP），突觸可塑性增強［13］。在小鼠海馬CA3 和齒狀回區(qū)，miR?29c 還可以抑制JAK2/STAT3信號通路激活，IL?1β，IL?6 和TNF?α 等炎癥因子產(chǎn)生減少，神經(jīng)元樹突棘與分支數(shù)目增加，水迷宮實驗結(jié)果顯示小鼠認知功能得到加強［18-19］。

miR?29c 在神經(jīng)元發(fā)育分化、突起生長和突觸可塑性等神經(jīng)系統(tǒng)生理方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，而深入了解miR?29c 在神經(jīng)系統(tǒng)的生理調(diào)節(jié)作用可以為后續(xù)研究各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供有效的理論依據(jù)。

4 miR?29c 參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病變過程

4.1 miR?29c 與膠質(zhì)瘤病變膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)惡性腫瘤中最常見的類型之一，依據(jù)惡性程度劃分為WHOⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級。WANG 等［20］報道正常腦組織中miR?29c 標記指數(shù)（53.7%）明顯高于膠質(zhì)瘤組織（WHOⅠ-Ⅱ級18.9%，WHOⅢ級5.5%，WHOⅣ級1.8%）。同時HUI等［21］檢測到膠質(zhì)瘤患者外周血中miR?29c 表達量顯著下降，且與腫瘤分化程度呈正相關(guān)?？梢婋S著膠質(zhì)瘤惡性程度增高，瘤體和外周血中miR?29c 的表達量不斷下降，這提示在腫瘤組織以及外周血中miR?29c的表達波動在一定程度上可以反映膠質(zhì)瘤的惡性程度。LUO 等［15］通過與正常人類星形膠質(zhì)細胞相比，發(fā)現(xiàn)不同的膠質(zhì)瘤細胞系中（U251、U87、T98G、A172 以及SHG44）miR?29c 的表達量均顯著降低，并且在具有替莫唑胺（TMZ）耐藥性的膠質(zhì)瘤細胞U251 和U87 中檢測到miR?29c的表達更進一步降低。另有周景儒等［22］研究顯示膠質(zhì)瘤手術(shù)切除后患者血清中miR?29c的表達往往比術(shù)前要高；而且血清miR?29c 高表達患者1年生存率（95%）要比低表達患者（77%）高。在復(fù)發(fā)性膠質(zhì)瘤組織中觀察到多種miRNA 表達下降，其中miR?29c 下降近70%，是降低幅度最大的miRNA。因而可見外周血miR?29c 含量變化在一定程度上可作為評價膠質(zhì)瘤患者預(yù)后檢測指標。但是血清miR?29c 的表達量與膠質(zhì)瘤患者的性別、年齡、腫瘤位置、病理類型和卡氏功能狀態(tài)評分（KPS）無相關(guān)性。

miR?29c 表達下降在膠質(zhì)瘤發(fā)病及病變進程里發(fā)揮的作用：（1）影響膠質(zhì)瘤的增殖速度與侵襲能力：與相鄰正常腦組織相比，在原發(fā)性膠質(zhì)瘤組織中miR?29c 表達明顯下降，與周期蛋白依賴激酶6（cyclin?dependent kinase 6，CDK6）的3′?UTR 結(jié)合減少使其表達上升，導(dǎo)致瘤細胞增殖速度加快。但在體外試驗中使U251 和U87 膠質(zhì)瘤細胞過表達miR?29c 后，CDK6 表達減少，細胞周期蛋白D1和E 表達也減少，而CDK 抑制因子p27 和p21 增加，最終使細胞周期阻滯在G1 期，瘤細胞的增殖能力下降；同時作用于MMP?2 和VEGF 的3′?UTR使其表達明顯下調(diào)，提示瘤細胞的侵襲遷移和血管再生能力受到顯著抑制［20］。（2）影響膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的敏感性：一方面，c?Myc/miR?29c/REV3L通路參與此效應(yīng)，在裸鼠顱內(nèi)原位移植瘤模型中隨著原癌基因c?Myc 表達上升，通過與miR?29c 啟動子結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄從而使其表達下降，下游靶點REVL3 的表達增加，替莫唑胺的療效降低產(chǎn)生抗藥性，裸鼠生存期明顯縮短，但沉默c?Myc 聯(lián)合替莫唑胺治療則瘤體積顯著減小，裸鼠生存期相對延長；在抵抗替莫唑胺的U251 膠質(zhì)瘤細胞中過表達miR?29c 后并用替莫唑胺處理，miR?29c 通過直接與下游靶點REV3L 的3′?UTR 結(jié)合使其表達顯著下降，γ?H2AX 的表達上升，進一步促進替莫唑胺致使的DNA 斷裂損傷使膠質(zhì)瘤細胞中DNA 雙鏈損傷和染色體斷裂片段增多，細胞活力下降，caspase?3 被激活，凋亡率上升，提示膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺重新產(chǎn)生敏感性［15］。另一方面，XIST/miR?29c/Sp1/MGMT 通路也參與了膠質(zhì)瘤對替莫唑胺敏感性降低過程，與正常腦組織對比，膠質(zhì)瘤組織XIST 表達明顯上升，通過特異性“海綿”結(jié)合方式使miR?29c 表達下降，其下游靶點特化蛋白1（specificity protein?1，SP1）和O6?甲基鳥嘌呤?DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6 methylguanine?DNA methyltransfer?ase，MGMT）表達增加；同樣，在膠質(zhì)瘤細胞U251（具有抗替莫唑胺效應(yīng)）過表達miR?29c后，miR?29c作用于Sp1 的3′?UTR，抑制其表達從而使DNA 失配修復(fù)通路的重要蛋白MGMT 和MSH6 的啟動子活性下降，U251 無法修復(fù)替莫唑胺誘導(dǎo)的堿基失配，從而導(dǎo)致DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)破壞，凋亡相關(guān)通路被激活，提示膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性加強［23］。以上研究表明，miR?29c 與膠質(zhì)瘤的病理進程密切相關(guān)，目前臨床上關(guān)于膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的耐藥性仍是一個棘手問題［24］，未來通過測序技術(shù)不斷深入研究分子機制挖掘出更有效的靶點，或許可以為臨床治療或藥物研發(fā)提供新方向。

4.2 miR?29c 與阿爾茲海默?。╝lzheimer disease，AD）ZONG 等［10］研究表明在3 ～ 6月齡APPswe/PSDeltaE9 轉(zhuǎn)基因AD 小鼠的海馬組織，miR?29c 表達顯著升高，但miR?29a/b 表達量沒有發(fā)生改變；而在前額葉皮層miR?29c表達顯著下降。SORENSEN等［25］通過miRNA 測序發(fā)現(xiàn)在AD 患者腦脊液和血清中有多種顯著差異表達miRNAs，其中miR?29c在表達譜變化中下降程度最高，這提示腦脊液和血清miR?29c 含量下降可作為AD 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵事件。此外，在AD 小鼠中通過靜脈注射慢病毒過表達miR?29c 后，認知功能也得到明顯改善［19］。有關(guān)miR?29c 參與AD 進程的分子機制主要有：（1）miR?29c/DNMT3/BDNF 信號通路：在AD 患者的腦脊液中miR?29c 的表達下降，DNMT3 表達增加，導(dǎo)致BDNF 的基因啟動子甲基化水平顯著升高；而在大鼠海馬神經(jīng)元過表達miR?29c 后，直接作用于DNMT3 的3′?UTR 顯著降低其表達，隨后BDNF 基因啟動子甲基化水平降低，BDNF表達升高，TrkB和Erk 磷酸化增強［13］；在神經(jīng)元的胞質(zhì)和軸突分布的神經(jīng)元導(dǎo)向因子3（NAV3）表達下降，神經(jīng)纖維纏結(jié)現(xiàn)象減輕［10］。（2）通過靶向β 位淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β?site amyloid precursor protein cleaving enzyme protein 1，BACE1），影響淀粉樣前體蛋白（Aβ）生成：AD患者大腦miR?29c表達下降而BACE1和Aβ表達同步上升。同時外源性Aβ作用于SK?N?SH 和CHP212 人神經(jīng)母細胞瘤細胞，miR?29c 表達隨Aβ 濃度增加而下降，其下游靶點TNFAIP1 和NF?κB 的表達隨Aβ 濃度增加而上升，Bcl?2 的表達下降，Bax 與cleaved caspase?3 的表達量增加［26］；在SAMP8 小鼠海馬區(qū)注射miR?29c 模擬物后，與BACE1 的3′?UTR 結(jié)合抑制其表達，PKA/CREB 信號通路被激活，Aβ 表達明顯減少，AD 小鼠認知功能障礙得到改善［27］。此外大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞來源的細胞外囊泡高表達miR?29c 之后將注射到AD 大鼠腦室內(nèi)，也觀察到大腦皮層和海馬炎癥因子表達下降，BACE1 表達和Aβ 斑塊形成減少，Wnt/β?catenin 信號通路被激活，AD 大鼠認知功能障礙減輕［28］。

4.3 miR?29c 與帕金森癥（parkinson′s disease，PD）Hoehn&Yahr 分期（HY 分期）常用于臨床評估PD 嚴重程度，隨著分期指數(shù)增加病情持續(xù)加重。BAI 等［29］用基因組測序證實HY?1、HY?2 和HY?3 期患者血清miR?29c 表達下降，HY?3 期下降最顯著，但腦脊液miR?29c 表達變化不明顯。miR?29c 參與PD 進程的分子機制主要有：（1）miR?29c/SP1 通路：MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠中腦黑質(zhì)致密部miR?29c 表達明顯下調(diào)，而SP1 表達上升，α?突觸核蛋白堆積，多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少；PD 小鼠右側(cè)腦室注射miR?29c 激動劑可以作用于SP1 的3′?UTR 抑制其表達，可逆轉(zhuǎn)上述損傷效應(yīng)；而在MPP+處理的SH?SY5Y 細胞中過表達miR?29c，SP1表達降低［9］。（2）miR?29c/NFAT5通路：miR?29c直接作用于激活T 細胞核因子5（NFAT5）的3′?UTR，抑制膠質(zhì)細胞活化，炎性小體NLRP3 表達和NF?κB激活減弱，導(dǎo)致炎癥因子TNF?α，IL?1β，IL?6 以及促凋亡因子caspase?3和caspase?9表達下降，同時谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白GLT1 和GLAST 表達增加，可以防止谷氨酸過度積累造成神經(jīng)元損傷［4，16，30］。（3）circ?SAMD4A/miR?29c/AMPK/mTOR 通路：在MPTP 誘導(dǎo)的PD 動物以及SH?SY5Y 細胞模型，均觀察到miR?29c 表達下降是因為受到源于circSAMD4A 的負向調(diào)節(jié)；circSAMD4A 基因敲減之后miR?29c 表達隨即上升，AMPK 磷酸化減弱而mTOR 的磷酸化增強，LC3II 和Beclin 的表達下降，提示MPTP 或MPP+導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡及自嗜得到緩解［31］?？梢?，miR?29c 通過作用于多個下游靶點參與了AD和PD 等神經(jīng)退行性疾病的病變環(huán)節(jié)，但目前并不確定miR?29c 發(fā)揮作用影響的是這些腦區(qū)的哪一類神經(jīng)元亞群的功能，尚需進一步細化。

4.4 miR?29c 與腦損傷創(chuàng)傷性腦損傷患者的前額葉皮層和尾殼核中miR?29c 表達均下降［32-33］。在缺血再灌注小鼠海馬組織和氧?糖剝奪的PC12細胞中均可見miR?29c 表達下降，但腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）以及IL?1β，IL?6 和TNF?α 表達增加［6-7］；在腦卒中大鼠腦室內(nèi)注射miR?29c激動劑，通過作用于促分裂原活化蛋白激酶激酶6（Map2k6）、Bak1 以及Birc2 的3′?UTR，抑制caspase?3 活性和p53 凋亡因子表達，PI3K/AKT 通路被部分阻斷，促凋亡因子Bax 和Bak 表達下調(diào)，減緩缺血缺氧致使的神經(jīng)元凋亡［33］。此外，ZHANG 等［34］在軟骨素蛋白多糖（CSPGs）介導(dǎo)大腦皮層神經(jīng)元軸突損傷中發(fā)現(xiàn)miR?29c 表達上升，通過西地那非提高軸突中環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）的表達，使miR?29c 表達下降，與整合素β1（ITGB1）的3′?UTR 結(jié)合減少，從而激活I(lǐng)TGB1/FAK/RhoA 信號通路減輕軸突損傷。從這些研究來看，在不同腦損傷類型中，損傷區(qū)域miR?29c 表達趨勢并不完全一致，這有可能是實驗?zāi)Ｐ偷牟町愒斐傻?，但也不排除由于病變時間點或?qū)嶒灧椒ú煌斐蓪嶒灲Y(jié)果的差異。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，miR?29c不僅與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)，也參與了一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。在患者的血清或腦脊液中，檢測到miR?29c 的表達發(fā)生了不同程度的改變，這提示miR?29c 有可能成為檢測或評估某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病進展的特異性標記物。在動物試驗中外源性補充miR?29c 可以增加膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性，抑制腫瘤細胞增殖；可以作用于DNMT3，BACE1，SP1，NFAT5 等多個下游靶基因抑制其表達，從而減輕神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。但miR?29c在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用并非都是有益的，比如在糖尿病周圍神經(jīng)病變小鼠的背根神經(jīng)節(jié)中miR?29c 表達上升，神經(jīng)元軸突損傷加重［11］；在缺血缺氧大鼠小腦頂核中過表達miR?29c的同時大腦梗死區(qū)域有所增加［33］。因此，有必要深入研究miR?29c 與神經(jīng)系統(tǒng)疾病中不同靶點的相互關(guān)系以及在不同腦區(qū)的作用，確定并控制miR?29c 表達在合理范圍內(nèi)，這更有助于受損神經(jīng)元的功能修復(fù)。關(guān)于此類研究有助于將來研發(fā)潛在有價值的小分子核酸藥物，并為臨床診治神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新思路。