注射型富血小板纖維蛋白聯(lián)合BMSCs在坐骨神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究

葉 放 王彥生 于 寧 許 蕙

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院手外5 科，遼寧沈陽(yáng) 110000

外周神經(jīng)損傷后其后續(xù)影響及功能恢復(fù)的病理生理過(guò)程十分復(fù)雜，神經(jīng)組織的修復(fù)過(guò)程相對(duì)緩慢、再生生理較差[1]，而且損傷后發(fā)生局部粘連、組織萎縮和運(yùn)動(dòng)終板退化可能性較大，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)功能的損傷修復(fù)受到影響，是目前顯微外科重點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題[2]。干細(xì)胞移植作為當(dāng)今顯微外科神經(jīng)修復(fù)治療的新型手段，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是目前較為實(shí)用的種子細(xì)胞，尤其在外周神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。雖然其臨床應(yīng)用較為廣泛，但其仍存有一定不足，如體外培養(yǎng)歸巢率低，移植后細(xì)胞存活能力欠佳等[4]。注射用富血小板纖維蛋白具有較高的促生長(zhǎng)因子釋放率，從而更有效地誘導(dǎo)BMSCs 的生產(chǎn)與分化[5]。為更好地提高外周神經(jīng)損傷的修復(fù)治療效果，本研究通過(guò)對(duì)大鼠應(yīng)用自體注射型富血小板纖維蛋白聯(lián)合BMSCs 進(jìn)行治療，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

DMEM 培養(yǎng)基由美國(guó)HyClone 公司提供（生產(chǎn)批號(hào)：20180201），十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）配膠試劑盒由上海碧云天生物科技公司提供（生產(chǎn)批號(hào)：201811058），CKX41型倒置相差顯微鏡由日本奧林巴斯公司提供，7000型透射電鏡由日本東芝公司提供。

1.2 研究對(duì)象

選擇10日齡SD 乳鼠6只，雌雄各半，體重為25～35 g；另外選擇2月齡SD 大鼠24只，雌雄各半，體重195～225 g；均購(gòu)自沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：20191105）。本研究造模及入組動(dòng)物選擇均通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意，SD 大鼠常溫下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周備用。

1.3 方法

1.3.1 大鼠BMSCs 及注射型富血小板纖維蛋白的制備 取6只乳鼠采用離頸法處死，采集由DMEM 培養(yǎng)基從雙側(cè)脛骨干骺端沖洗骨髓，離心管反復(fù)吹打制備細(xì)胞懸液，隨后嚴(yán)格按照密度梯度離心法進(jìn)行細(xì)胞分離、培養(yǎng)和傳代，選擇培養(yǎng)3 周后第4 代純化BMSCs群備用。注射型富血小板纖維蛋白以改良低速離心法進(jìn)行，具體通過(guò)SD 大鼠眼眶采血法采集自體血，置于低速離心管內(nèi)離心3 min后獲取漿液層與紅細(xì)胞層中間的富血小板纖維蛋白層，所制備富血小板纖維蛋白無(wú)需抗凝，但要求在制備成功后15 min 內(nèi)應(yīng)用。

1.3.2 分組治療 將24只2月齡SD 大鼠隨機(jī)分為觀察組與對(duì)照組，各12只，以改良擠壓損傷法制作大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，先注射3%戊巴比妥實(shí)施腹腔麻醉，隨后雙側(cè)后肢脫毛，無(wú)菌條件下對(duì)實(shí)驗(yàn)側(cè)坐骨神經(jīng)止血鉗上齒擠壓45 s，將坐骨神經(jīng)積壓呈扁薄狀即為模型制備成功。造模后，觀察組與損傷部位局部注射BMSCs 懸液250 μl 及自體富血小板纖維蛋白250 μl，對(duì)照組局部注射生理鹽水500 μl，治療14 d后進(jìn)行相關(guān)結(jié)果分析。

1.3.3 觀察指標(biāo) 比較治療前后兩組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)變化情況；分析兩組治療14 d后大鼠坐骨神經(jīng)軸突透射電鏡圖像結(jié)果；統(tǒng)計(jì)兩組治療14 d后腓腸肌濕質(zhì)量變化情況。坐骨神經(jīng)功能指數(shù)為監(jiān)測(cè)神經(jīng)損傷后恢復(fù)情況的一種無(wú)創(chuàng)檢測(cè)手段，以訓(xùn)練小鼠沿限定軌跡走動(dòng)，并通過(guò)后爪不同顏色無(wú)毒染料印跡為標(biāo)準(zhǔn)，記錄治療前及治療14 d后兩組實(shí)驗(yàn)大鼠沿軌跡行走指標(biāo)，結(jié)合爪長(zhǎng)度、腳趾展開長(zhǎng)度等綜合計(jì)算，計(jì)算公式選擇Bain 公式進(jìn)行，具體為SFI=109.5（ETSNTS）/NTS-38.3（EPL-NPL）/NPL+13.3（EIT-NIT）/NIT-8.8（N：正常足；E：傷側(cè)足；PL：足印長(zhǎng)度；TS：足趾寬度；IT：中間足趾寬度；）,其中SFI=0 為正常，SFI=-100為完全損傷；腓腸肌濕質(zhì)量指標(biāo)包括：健側(cè)與實(shí)驗(yàn)側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量數(shù)據(jù)，并計(jì)算腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率，通過(guò)十萬(wàn)分之一精度電子天平秤測(cè)定治療14 d后雙側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量，腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率=實(shí)驗(yàn)側(cè)（g）/正常側(cè)（g）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較使用配對(duì)t 檢驗(yàn)，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后坐骨神經(jīng)功能指數(shù)變化的比較

治療前兩組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），治療后兩組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且治療后觀察組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組治療前后坐骨神經(jīng)功能指數(shù)變化的比較（±s）

表1 兩組治療前后坐骨神經(jīng)功能指數(shù)變化的比較（±s）

組別只數(shù) 治療前 治療后 t 值 P 值觀察組對(duì)照組t 值P 值12 12 85.6±13.2 85.5±13.3 0.018 0.985 5.9±0.3 29.3±1.9 42.141 0.000 20.910 14.491 0.000 0.000

2.2 兩組治療14 d后大鼠坐骨神經(jīng)軸突透射電鏡圖像

兩組大鼠坐骨神經(jīng)透射電鏡提示有髓鞘軸突比例情況提示，治療14 d后，大鼠坐骨神經(jīng)透射電鏡提示觀察組髓鞘軸突比例高于對(duì)照組（圖1~2）。

圖1 對(duì)照組治療14 d后大鼠坐骨神經(jīng)軸突透射電鏡圖（400×）

圖2 觀察組治療14 d后大鼠坐骨神經(jīng)軸突透射電鏡圖（400×）

2.3 兩組治療14 d后腓腸肌濕質(zhì)量變化情況的比較

治療后兩組健側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后觀察組實(shí)驗(yàn)側(cè)腓腸肌濕質(zhì)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療后觀察組腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 兩組治療14 d后腓腸肌濕質(zhì)量變化情況的比較（±s）

表2 兩組治療14 d后腓腸肌濕質(zhì)量變化情況的比較（±s）

腓腸肌濕質(zhì)量（g）健側(cè) 實(shí)驗(yàn)側(cè)組別只數(shù) 腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率（%）觀察組對(duì)照組t 值P 值12 12 0.52±0.02 0.53±0.02 1.225 0.234 0.46±0.01 0.37±0.01 22.045 0.000 88.50±0.03 69.80±0.06 965.664 0.000

3 討論

神經(jīng)組織損傷后雖具有一定的組織重塑能力，但隨著微環(huán)境的改變?yōu)槌霈F(xiàn)不可逆性改變[6]，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)修復(fù)與再生能力被抑制，給目前臨床上針對(duì)外周神經(jīng)損傷的修復(fù)其仍屬于治療難點(diǎn)[7]。以往治療上多以神經(jīng)電刺激等進(jìn)行治療，雖具有一定效果[8]，但整體療效有待提高。近年神經(jīng)支架、種子細(xì)胞及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等生物工程手段的臨床應(yīng)用，為神經(jīng)組織修復(fù)帶來(lái)巨大突破[9]。

針對(duì)外周神經(jīng)損傷，本研究制備大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，其中觀察組使用自體注射型富血小板纖維蛋白聯(lián)合BMSCs 進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，治療前兩組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后觀察組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)低于同組治療前及對(duì)照組治療后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。證明針對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，使用自體注射型富血小板纖維蛋白聯(lián)合BMSCs 進(jìn)行治療，相對(duì)于注射生理鹽水的對(duì)照組，能更好地促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)的提高，促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能的恢復(fù)。治療14 d后，大鼠坐骨神經(jīng)透射電鏡提示觀察組有髓鞘軸突比例高于對(duì)照組（P＜0.05），提示自體注射型富血小板纖維蛋白聯(lián)合BMSCs在治療大鼠坐骨神經(jīng)損傷方面，促進(jìn)損傷神經(jīng)軸突再生具有重要意義。治療14 d后，觀察組腓腸肌濕質(zhì)量高于對(duì)照組，且觀察組腓腸肌濕質(zhì)量恢復(fù)率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步說(shuō)明針對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，自體注射型富血小板纖維蛋白聯(lián)合BMSCs 治療對(duì)促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、血管形成等具有重要價(jià)值。

BMSCs 是一種具有自我更新、多向分化和分泌功能的多能干細(xì)胞[10]，以旁分泌集落刺激因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等多種細(xì)胞因子進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，組織形成的目的[11-12]。另外，本研究使用的自體富血小板纖維蛋白聯(lián)合BMSCs在神經(jīng)局部鞘內(nèi)注射，更好地為神經(jīng)修復(fù)提供充足營(yíng)養(yǎng)，并在15 min 內(nèi)注射，避免了凝膠狀態(tài)[13]，加大組織流動(dòng)性，提高了臨床應(yīng)用效果；而且通過(guò)其釋放的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，顯著提高BMSCs增殖與分化能力，并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的黏附、遷移效應(yīng)，提高細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水平，進(jìn)而更好地誘導(dǎo)BMSCs 增殖與分化[14-16]，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞與血管的形成，確保神經(jīng)組織血管的重塑與增殖，達(dá)到修復(fù)受損神經(jīng)的目的[17-18]。

綜上所述，針對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠，使用自體注射型富血小板纖維蛋白聯(lián)合BMSCs 進(jìn)行治療，能有效提高坐骨神經(jīng)功能，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，提高平滑肌與血管再生能力。