針刺治療腦缺血再灌注損傷相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制研究進(jìn)展

張勇

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院,蘭州 730000)

在中醫(yī)學(xué)中,腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI)的記載最早見于《內(nèi)經(jīng)》中,又名“卒中”“薄厥”等,屬于“中風(fēng)病”范疇。西醫(yī)學(xué)的CIRI是指腦缺血一定時(shí)間,在梗死相關(guān)血管開通恢復(fù)血液供應(yīng)后,卻出現(xiàn)了比血管閉塞時(shí)更加嚴(yán)重的急性腦功能障礙。世界上每年約有 1500多萬患者遭受缺血性腦血管病的折磨,中國每年約有 200多萬人罹患腦血管疾病,且本病每年還在呈增多趨勢發(fā)展,嚴(yán)重影響人們的健康[1-2]。CIRI的病理生理機(jī)制包括能量代謝紊亂、興奮性毒性、自由基損傷、鈣超載、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[3-4]。本病治愈率極低,致殘率和高死亡率極高,預(yù)后極差,越來越多的研究關(guān)注于非藥物療法,尤其是傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)療法。目前有大量研究表明,針灸對(duì)于CIRI有著良好的治療效果[5-6]。其中,針刺療法是針灸治療中最常應(yīng)用的一種方法,該方法主要通過疏通經(jīng)絡(luò)、行氣活血來達(dá)到調(diào)理人體機(jī)能的作用。近年來,針刺療法在治療CIRI方面療效顯著,因具有適應(yīng)證廣、操作方便、經(jīng)濟(jì)安全、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn),深受患者的歡迎。筆者通過總結(jié)近年來針刺對(duì)CIRI的最新治療機(jī)制研究進(jìn)展,以期為CIRI的中醫(yī)學(xué)臨床治療提供參考,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 針刺治療與細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞受損傷后釋放出的分子,包括促炎因子和抗炎因子兩種。缺血性損傷導(dǎo)致的局部炎性反應(yīng)會(huì)引起細(xì)胞因子的大量釋放。促炎細(xì)胞因子主要包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素-6(IL-6)等,這些促炎細(xì)胞因子可誘導(dǎo)白細(xì)胞遷移至缺血腦組織區(qū)域,這些聚集的白細(xì)胞進(jìn)一步釋放更多的促炎細(xì)胞因子,加重腦組織的缺血損傷[7]。直接靶向抑制這類促炎細(xì)胞因子和促進(jìn)抗炎因子的釋放可有效改善和治療CIRI[8]。針刺治療可動(dòng)態(tài)調(diào)控各類炎癥因子,包括白介素(IL)、腫瘤壞死因(tumor necrosis factor, TNF)、細(xì)胞間黏附分子(inter cellular adhesion molecule, ICAM)、干擾素(interferon,IFN)等,同時(shí)減緩細(xì)胞毒性、減少細(xì)胞凋亡、保護(hù)血腦屏障。

TNF-α是一種具有致炎作用的細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)其他炎癥信號(hào)通路的激活,使機(jī)體內(nèi)的炎癥進(jìn)一步加重和擴(kuò)散。方晨晨等[9]采用改良 Longa線栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈腦缺血大鼠模型,并于2 h后拔出線栓開始再灌注時(shí)針刺百會(huì)、大椎穴,結(jié)果顯示,大鼠CIRI后腦組織中TNF-α基因及蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組顯著增加,表明機(jī)體受到缺血組織血流再通的二次損傷后,產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng),快速刺激 TNF-α的大量釋放表達(dá),進(jìn)一步激活體內(nèi)其他炎癥信號(hào)通路,從而加重體內(nèi)的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致炎癥擴(kuò)散,造成惡性循環(huán);而針刺百會(huì)、大椎穴后,針刺組TNF-α基因及蛋白表達(dá)量均較模型組顯著降低,推測電針干預(yù)通過抑制腦缺血再灌注模型大鼠的促炎因子 TNF-α的分泌抑制促炎細(xì)胞在缺血區(qū)的聚集和激活,有效減緩缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng),改善腦缺血程度,幫助缺血再灌注損傷腦組織神經(jīng)功能的恢復(fù)。許軍峰等[10]也使用線栓法制作大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)型腦缺血大鼠模型,缺血90 min后行再灌注時(shí)針刺內(nèi)關(guān)、水溝、三陰交3個(gè)穴位,結(jié)果表明,MCAO模型組腦缺血6 h時(shí)TNF-α mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低,IFN調(diào)節(jié)因子(interferon regulation factor,IRF)-7 mRNA和IFN-β mRNA表達(dá)則較假手術(shù)組明顯升高,而MCAO模型組腦缺血5 d時(shí)TNF-α mRNA表達(dá)和IRF-7 mRNA則較模型組明顯降低,這種表達(dá)差異說明腦缺血再灌注后6 h和5 d時(shí)炎癥因子的表達(dá)升高與否與炎癥因子的啟動(dòng)時(shí)間密切相關(guān)。而針刺組在腦缺血 6h TNF-α mRNA表達(dá)較模型組明顯升高,IRF-7 mRNA表達(dá)則明顯降低,IRF-7 mRNA和IFN-β mRNA在腦缺血5d時(shí)則較模型組明顯升高,說明針刺治療不能抑制TNF-α mRNA表達(dá),但能夠抑制IRF-7 mRNA的表達(dá)和促進(jìn) IFN-β mRNA表達(dá),從而極大地改善了CIRI模型大鼠的神經(jīng)功能活動(dòng),能夠減緩CIRI的程度,本實(shí)驗(yàn)也說明CIRI后至少5 d內(nèi)不宜針刺,因?yàn)? d內(nèi)針刺具有誘發(fā)腦水腫和加重腦神經(jīng)損害的風(fēng)險(xiǎn)。上述的研究結(jié)果充分說明,針刺對(duì)CIRI炎癥因子的干預(yù)效果取決于很多因素,如穴位的選擇、針刺治療的時(shí)間、不同炎癥因子的分泌時(shí)間等。

IL-1β在CIRI后,由浸潤到局部腦組織的單核-巨噬細(xì)胞、活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分泌[11],對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制如下,①IL-1β促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子、募集白細(xì)胞和刺激單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子而加重局部炎癥反應(yīng);②I L-1 β能夠促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(m a t r i x metalloproteinases, MMPs)的表達(dá),進(jìn)而破壞血腦屏障,促使缺血局部腦組織的炎癥反應(yīng),通過血流活化外周免疫系統(tǒng)中的炎性細(xì)胞,進(jìn)一步募集外周炎性細(xì)胞回流至缺血局部腦組織,加重炎癥反應(yīng);Paredes SD等[12]通過建立 Wistar雄性大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞的模型,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長,IL-1β會(huì)逐漸增加,加重炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡,而通過抑制 IL-1β能達(dá)到保護(hù)神經(jīng)功能的作用。IL-6是重要的炎癥介質(zhì),可導(dǎo)致腦炎性損傷,主要在腦缺血急性期表達(dá)急劇升高[13],其水平是反應(yīng)腦缺血損傷早期的靈敏性指標(biāo)。有研究[14]報(bào)道,MCAO模型中IL-6在外周2 h即開始上升,早于腦組織24 h開始上升。葛建彬等[15]采用頸總動(dòng)脈栓線法和缺血 2 h后拔出栓線造成短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)小鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注后 24 h,CIRI模型小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平較假手術(shù)組明顯升高,NF-κB p65蛋白表達(dá)也顯著升高,而枸杞多糖干預(yù)后,則可以使 CIRI模型小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平明顯降低,NF-κB p65蛋白表達(dá)也顯著降低。這一結(jié)果說明,腦缺血可以激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)一步活化缺血腦組織中的單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等炎癥細(xì)胞,從而大量分泌 TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β等炎性細(xì)胞因子,從而促進(jìn)胞外氧自由基、細(xì)胞因子、溶酶體酶等炎癥介質(zhì)的大量釋放進(jìn)一步加重腦組織損傷,引起 CIRI[16]。陳人豪等[17]用改良Longa法制備CIRI大鼠模型后研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),CIRI大鼠模型腦組織SOD、GSH-Px活性較假手術(shù)組顯著降低,MDA、IL-6、IL-1β及TNF-α水平則較假手術(shù)組顯著升高,而給予刺五加干預(yù)后,則使CIRI大鼠模型腦組織SOD、GSH-Px活性顯著升高,MDA、IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著降低。這一結(jié)果則說明CIRI中,氧化應(yīng)激決定著炎性細(xì)胞因子的分泌狀態(tài),氧化應(yīng)激會(huì)促進(jìn)活性氧和促炎細(xì)胞因子 IL-6、IL-1β及 TNF-α的分泌,同時(shí)也會(huì)促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子 IL-6、IL-1β及 TNF-α的產(chǎn)生,進(jìn)一步加重 CIRI程度。王博等[18]采用改良的MCAO線栓法缺血2 h后行再灌注3 h復(fù)制右側(cè)局灶性CIRI大鼠模型后進(jìn)行針刺百會(huì)、腎俞、三陰交等穴位電針預(yù)處理后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺治療組海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量和NF-κB的蛋白表達(dá)均較模型組顯著降低,提示標(biāo)本配穴電針預(yù)處理可能抑制 NF-κB表達(dá),從而抑制 NF-κB下游炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌而減輕炎性反應(yīng),從而保護(hù)CIRI大鼠模型的神經(jīng)元。陳素輝等[19]研究也發(fā)現(xiàn),針刺CIRI模型大鼠的督脈百會(huì)穴、足三里穴后,在患側(cè)缺血腦區(qū)的IL-6表達(dá)水平在12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和144 h等時(shí)間點(diǎn)均顯著降低。還有研究[20-21]發(fā)現(xiàn),電針治療能顯著減少腦缺血/再灌注模型大鼠TNF-α和 IL-6的含量。同樣,電針能同時(shí)抑制大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注區(qū)腦組織和血清中 TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,從而改善大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注大鼠的腦梗死面積以及其運(yùn)動(dòng)能力[22]?？寡滓蜃影捉樗?10(IL-10)在調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)的負(fù)反饋途徑中發(fā)揮重要作用,可抑制多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[23]。王濤等[24]通過線栓法夾閉頸內(nèi)、頸總動(dòng)脈血管缺血2 h后拔出尼龍線復(fù)制 CIRI大鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠 TNF-α、IL-1β含量明顯高于假手術(shù)組,IL-10含量明顯低于假手術(shù)組,七氟烷預(yù)處理則可以促使 TNF-α、IL-1β含量降低,IL-10含量升高。說明CIRI中抗炎因子的分泌減少,使其對(duì)炎癥因子 TNF-α、IL-1β的調(diào)控作用減弱,從而極大地促進(jìn)了促炎因子的分泌,加重了CIRI的程度,加重了其神經(jīng)損傷。葉濤等[25]采用改良Longa線栓法制備腦缺血再灌注大鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),再灌注 12 h,電針預(yù)處理組血清 TNF-α含量較模型組降低,血清IL-10含量則較模型組顯著增加較高;再灌注24 h,電針預(yù)處理組血清 TNF-α和IL-10含量均較模型組降低,說明電針可能通過調(diào)節(jié)腦缺血再灌注急性期外周循環(huán)血中促炎因子 TNF-α與抗炎因子 IL-10間動(dòng)態(tài)平衡,從而對(duì)抗其炎性反應(yīng)的加劇,緩解其神經(jīng)損傷。而WANG P等[26]則發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注6 h模型鼠的血清 IL-10含量是升高的,但電針干預(yù)不能調(diào)節(jié)血清IL-10水平的下降。這一結(jié)果說明,IL-10等細(xì)胞因子的表達(dá)受到很多因素調(diào)控,比如外源性條件(實(shí)驗(yàn)環(huán)境、電針穴位選取、干預(yù)時(shí)間),內(nèi)源性環(huán)境(CIRI的造模方法、再灌注時(shí)間、再灌注損傷程度)。Dai X等[27]研究則發(fā)現(xiàn)這些炎癥因子還能激活機(jī)體內(nèi)凋亡信號(hào)通路,使細(xì)胞發(fā)生凋亡,加重腦缺血的神經(jīng)損傷。因此,針刺治療 CIRI的機(jī)制可能是通過抑制炎癥因子的表達(dá)和促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)來抑制缺血性腦組織梗死區(qū)的炎性細(xì)胞浸潤和防止血腦屏障的破壞,或者是通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來抑制促炎因子的產(chǎn)生和分泌,進(jìn)一步減少缺血性腦組織梗死區(qū)的炎性細(xì)胞浸潤,有效減緩神經(jīng)損傷,還可能是通過抑制NF-κB表達(dá),從而抑制其下游區(qū)促炎因子的表達(dá),進(jìn)而抑制體內(nèi)凋亡信號(hào)通路,有效緩解腦缺血對(duì)梗死區(qū)的神經(jīng)損傷,從而發(fā)揮對(duì)缺血性腦組織神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng),改善其神經(jīng)功能。

2 針刺治療與自由基

自由基,又名游離基,是機(jī)體活動(dòng)代謝的中間產(chǎn)物,包括超氧陰離子(superoxide anion,O2﹣)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxides,LPO)以及羥自由基(hydroxyl free radicals,OH﹣)等。當(dāng)腦組織缺血時(shí),機(jī)體增多的自由基和自由基清除能力的下降破壞了其氧化與抗氧化作用的動(dòng)態(tài)平衡,使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷,這可能是導(dǎo)致CIRI的重要因素[28]。機(jī)體在缺血情況下,產(chǎn)生大量高活性分子如活性氧自由基和氮自由基,引起炎性細(xì)胞入侵,抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性和促進(jìn)丙二醛(malondialdehyde, MDA)等脂質(zhì)過氧化物分泌增多,產(chǎn)生氧化中間產(chǎn)物,造成組織細(xì)胞損傷[29]。邰東梅等[30]在眼針(眼針取穴采用自制大鼠眼針穴區(qū)定位器進(jìn)行穴區(qū)定位,標(biāo)記好肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)和腎區(qū))與體針(取大鼠曲池穴直刺 5 mm,足三里穴向右側(cè)刺入1 cm)對(duì)CIRI 24 h大鼠氧自由基和細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的差異研究中發(fā)現(xiàn),CIRI模型組大鼠血清中 SOD活性明顯低于正常組,MDA含量及ICAM-1蛋白和基因表達(dá)明顯高于正常組,給予眼針與體針治療后,干預(yù)組大鼠血清中 SOD活性較模型組明顯升高,血清MDA含量和腦組織ICAM-1蛋白及基因表達(dá)均較模型組明顯下降,眼針組與體針組之間 SOD活性、MDA含量和ICAM-1蛋白及基因表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果說明,眼針與體針通過提高SOD的活性和抑制MDA的含量來維持CIRI模型大鼠的氧化和抗氧化之間的動(dòng)態(tài)平衡,還通過抑制ICAM-1的表達(dá)抑制炎癥細(xì)胞在CIRI模型大鼠腦缺血區(qū)的大量聚集,從而減輕其炎癥反應(yīng)和神經(jīng)損傷。李丹等[31]研究也發(fā)現(xiàn),標(biāo)本配穴組(百會(huì)、腎俞、三陰交)和常規(guī)配穴組(百會(huì)、大椎、水溝)MDA含量均較模型組顯著降低,SOD活性和GSH-Px活性均較模型組顯著升高;標(biāo)本配穴組MDA含量顯著低于常規(guī)配穴組,SOD活性及GSH-Px活性均顯著高于常規(guī)配穴組。說明“標(biāo)本配穴”電針的治療機(jī)制可能是通過提高自由基清除酶的活性來清除體內(nèi)自由基的蓄積,從而減輕自由基對(duì)CIRI模型鼠神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷,達(dá)到治療作用。在針刺百會(huì)、四神聰對(duì)CI/RI模型大鼠抗氧化作用實(shí)驗(yàn)研究中[32],針刺組大鼠給予百會(huì)、四神聰穴針刺,每間隔8 h干預(yù)1次,至72 h結(jié)束,非穴區(qū)對(duì)照組大鼠分別于百會(huì)、四神聰穴區(qū)周邊5 mm處進(jìn)行針刺,每間隔8h進(jìn)行1次,至72 h結(jié)束。結(jié)果發(fā)現(xiàn),針刺組大鼠缺血半暗帶組織中 SOD、GSH-Px含量和Nrf2、p-Nrf2表達(dá)水平較非穴區(qū)對(duì)照組顯著升高,進(jìn)一步說明針刺治療可能是通過激活Nrf2信號(hào)通路來提高腦缺血再灌注模型大鼠缺血半暗帶腦組織中的抗氧化酶活性,從而減輕其氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮治療作用。黃玉棟等[33]在顱針對(duì)CIRI大鼠氧化應(yīng)激的影響實(shí)驗(yàn)中,顱針組采用 0.35 mm×13 mm毫針沿各顱骨縫頭皮線成 15°角針刺,針刺后施以電針(電流0.3 mA,疏密波,疏波頻率20 Hz,密波頻率100 Hz),以大鼠出現(xiàn)頭部輕度抖動(dòng)為度,留針30 min,每日1次,共治療7 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn),顱針治療組血漿SOD活性較模型組顯著升高,MDA和NO含量較模型組顯著降低,進(jìn)一步說明針刺治療的作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激途徑實(shí)現(xiàn)其保護(hù)作用的?？傊?針刺治療CIRI的另一機(jī)制可能是通過提高機(jī)體的抗氧化酶活性來清除機(jī)體自由基的蓄積和抑制機(jī)體氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生,從而維持機(jī)體氧化和抗氧化之間的動(dòng)態(tài)平衡,從而減輕缺血腦組織的氧化應(yīng)激損傷,或者是通過激活機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路 Nrf2信號(hào)通路來提高機(jī)體的抗氧化酶活性,維持機(jī)體氧化和抗氧化之間的動(dòng)態(tài)平衡,也能夠減輕缺血腦組織的氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)一步改善神經(jīng)細(xì)胞功能,從而發(fā)揮治療作用。

3 針刺治療與鈣離子(calcium, Ca2﹢)變化

CIRI的發(fā)生機(jī)制與Ca2﹢超載密切相關(guān)。Ca2﹢超載可觸發(fā)一系列包括半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶激活、ATP合成抑制、鈣依賴性蛋白酶與核酸內(nèi)切酶的激活等下游反應(yīng),最終導(dǎo)致CIRI后神經(jīng)元的損傷與死亡。相關(guān)研究顯示,腦缺血時(shí),各種原因如氧化應(yīng)激損傷可以引起Ca2﹢內(nèi)流增加,使細(xì)胞內(nèi)Ca2﹢含量增加,引起Ca2﹢超載,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2﹢級(jí)聯(lián)反應(yīng),引發(fā)缺血區(qū)腦神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡[34-35]。此外,腦缺血后造成的細(xì)胞內(nèi)Ca2﹢超載,會(huì)進(jìn)一步加重缺血腦組織區(qū)的細(xì)胞水腫和線粒體膜損傷,促進(jìn)其缺血腦組織區(qū)氧自由基和 CaM含量增高等,胞內(nèi)Ca2﹢可以與CaM結(jié)合形成復(fù)合物,后者通過促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì) 5-羥色胺和去甲腎上腺素的釋放來引起缺血腦組織的血管發(fā)生強(qiáng)烈收縮,從而加重腦缺血、缺氧的程度,造成惡性循環(huán)[36]。柳四新等[37]通過對(duì)大鼠MCAO模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Glu能夠促進(jìn)Ca2﹢內(nèi)流,提示Glu引起CIRI模型鼠Ca2﹢超載機(jī)制是通過L-型鈣通道鈣內(nèi)流后激活鈣庫釋放,致Ca2﹢內(nèi)流增加,最終引起缺血區(qū)的腦水腫。墻建軍等[38]對(duì)缺血再灌注損傷模型小鼠取百會(huì)和大椎穴進(jìn)行電針預(yù)處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可明顯抑制大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞TRPC6與Caspase-3蛋白表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi) Ca2﹢濃度,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。提示電針預(yù)處理可能通過下調(diào)TRPC6和減少細(xì)胞Ca2﹢內(nèi)流來抑制腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)凋亡,從而發(fā)揮對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦損傷的保護(hù)作用。為此,針刺治療調(diào)控CIRI的機(jī)制可能是通過抑制機(jī)體的各種氧化應(yīng)激反應(yīng)來減少細(xì)胞內(nèi) Ca2﹢內(nèi)流,從而減輕缺血腦組織區(qū)的細(xì)胞水腫和線粒體膜損傷,延緩缺血腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮防治作用,或者是通過抑制Ca2﹢-CaM復(fù)合物的形成,從而抑制血管收縮劑 5-羥色胺和去甲腎上腺素的釋放,緩解腦缺血缺氧,以保護(hù)腦組織。

4 針刺治療與細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核生物中的對(duì)機(jī)體生理病理中起重要作用的程序性降解機(jī)制,可通過包裹和分解損傷的生物大分子或細(xì)胞器而產(chǎn)生新的能量物質(zhì),供細(xì)胞循環(huán)再利用,從而維持細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)[39]。在CIRI中,細(xì)胞自噬被認(rèn)為是腦缺血后半暗帶內(nèi)的先于凋亡發(fā)生的第三種細(xì)胞死亡方式[40]。已有研究[41]證實(shí),腦缺血/再灌注損傷通過激活自噬來提高CIRI的神經(jīng)元存活,從而發(fā)揮保護(hù)作用。石秋艷等[42]研究也發(fā)現(xiàn),局部腦缺血模型大鼠海馬組織CA1區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)是顯著增加的,說明自噬的進(jìn)一步激活可以減輕CIRI程度。黃亞光等[43]對(duì)右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞缺血(MCAO)大鼠模型于術(shù)前5 d開始電針刺激百會(huì)和雙側(cè)曲池、足三里等穴,結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針組大鼠自噬小體較模型組顯著減少,皮層缺血區(qū) LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值較模型組顯著降低,p62的蛋白表達(dá)較模型組顯著上調(diào),說明電針預(yù)處理治療 CIRI的機(jī)制可能通過抑制其過度自噬而發(fā)揮對(duì)CIRI的神經(jīng)保護(hù)作用。而劉仁超等[44]在電針神庭、百會(huì)對(duì)腦缺血再灌注后認(rèn)知障礙大鼠海馬區(qū)自噬的影響的實(shí)驗(yàn)中,對(duì)左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞缺血大鼠模型于手術(shù)后2 h開始電針神庭穴和百會(huì)穴,結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針組神經(jīng)細(xì)胞中細(xì)胞器損傷較重,自噬及凋亡發(fā)生程度較高,LC3陽性細(xì)胞顯著增多及LC3蛋白表達(dá)顯著升高,提示電針神庭、百會(huì)等穴位可能通過誘導(dǎo)腦缺血再灌注大鼠梗死灶皮質(zhì)及海馬部位自噬的表達(dá)來發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。研究[45]發(fā)現(xiàn)電針?biāo)疁涎芟抡{(diào)Beclin1的表達(dá),且在再灌注24 h時(shí)下調(diào)最為顯著。而另一項(xiàng)研究[46]顯示了與之相反的結(jié)果,該研究發(fā)現(xiàn),在CIRI2h后,電針大鼠神庭、百會(huì)穴10 d,電針治療組可以增加Beclin1的表達(dá)來促進(jìn)自噬的發(fā)生而發(fā)揮腦保護(hù)作用。說明不同的穴位、干預(yù)方法、干預(yù)時(shí)間及 CIRI的程度決定了自噬體蛋白LC3和 Beclin1等的表達(dá)是上調(diào)還是下調(diào),也說明再灌注損傷的不同時(shí)段中自噬的作用是不同的,由此可見針刺對(duì)自噬具有雙向調(diào)控作用。因此,對(duì)CIRI機(jī)體可采取不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行針刺治療,通過誘導(dǎo)患者自身的自噬功能來發(fā)揮抗CIRI作用。

5 針刺治療與信號(hào)通路

5.1 針刺治療與 Janus激酶/信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白(Janus kinase/Signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號(hào)通路

JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條能夠參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)效應(yīng)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,同時(shí)介導(dǎo)機(jī)體免疫失調(diào)、炎癥反應(yīng)以及腫瘤生成等過程[47]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅參與神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育及衰老等生理過程,也同時(shí)參與部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程,特別是與腦缺血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程有著密切的關(guān)系[48]。研究證明JAK/STAT信號(hào)通路中可以影響神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等凋亡、增殖和分化的分子主要有 JAK1、STAT1、STAT3、STAT5[48-50]。

JAK2/STAT3信號(hào)通路在調(diào)控心腦血管疾病的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程中起著重要作用[50]。多項(xiàng)研究[51-53]表明,激活JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)CIRI具有神經(jīng)保護(hù)作用。而另有一些研究[54-55]結(jié)果則表明,在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ湍X組織缺血區(qū)域,p-STAT3呈高表達(dá),向缺血再灌注損傷模型大鼠側(cè)腦室注射JAK2特異性抑制劑AG490和 STAT3小分子干擾 RNA后會(huì)顯著降低 p-JAK2和p-STAT3的表達(dá),從而顯著降低中樞神經(jīng)內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量,從而減輕 CIRI模型鼠的中樞神經(jīng)受損程度,發(fā)揮保護(hù)作用。Zhao JB等[56]研究發(fā)現(xiàn)CIRI后p-JAK2、p-STAT3在缺血再灌注損傷半暗帶表達(dá)明顯增強(qiáng),減少其表達(dá)可減輕缺血神經(jīng)細(xì)胞的損傷。梁超等[57]發(fā)現(xiàn),在缺血再灌注早期使用頭針刺激頂顳前斜線和頂顳后斜線,可以降低p-JAK2含量以調(diào)控整合素連接激酶的表達(dá),減輕炎性反應(yīng);中后期使用頭針會(huì)增加 p-JAK2蛋白含量促進(jìn)其下游 p-STAT5蛋白表達(dá),從而改善受損腦皮質(zhì)的病理形態(tài)。蘇敏芝等[58]實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為,電針刺激大椎穴、百會(huì)穴可下調(diào)腦缺血區(qū) STAT3的表達(dá),可以改善腦功能?？梢?針刺治療通過抑制 JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白JAK2、STAT3等的表達(dá)來減輕炎性反應(yīng)和抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,從而減輕CIRI的神經(jīng)細(xì)胞損傷,發(fā)揮治療作用。

5.2 針刺治療與核轉(zhuǎn)錄因子-E2相關(guān)因子 2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)信號(hào)通路

Nrf2/ARE信號(hào)通路是細(xì)胞抵抗各種環(huán)境應(yīng)激和內(nèi)源性應(yīng)激防御機(jī)制中細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號(hào)調(diào)控通路[59]。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性降低,O2﹣濃度升高時(shí),會(huì)使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生理狀態(tài)下耦合在一起的 Nrf2與 Kelch樣 ECH聯(lián)合蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1, Keap1)發(fā)生解偶聯(lián),游離的Nrf2發(fā)生磷酸化,并移位轉(zhuǎn)入核內(nèi),與細(xì)胞核內(nèi)部的ARE元件發(fā)生結(jié)合,ARE與Nrf2在體內(nèi)相互作用,Nrf2通過調(diào)控ARE活化下游血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1, HO-1)和醌氧化還原酶1[NAD(P) H: quinone oxidoreductase 1, NQO1]等Ⅱ相抗氧化酶抗氧化物質(zhì)的表達(dá),同時(shí)產(chǎn)生大量抗氧化酶,發(fā)揮抗氧化作用。在Nrf2/ARE通路中,Nrf2的解偶聯(lián)和磷酸化為該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化的關(guān)鍵標(biāo)志。因此,Nrf2/ARE通路所發(fā)揮的調(diào)控作用成為了抗氧化藥物的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。大量研究[60-61]發(fā)現(xiàn),Nrf2/ARE通路在抗腦缺血缺氧氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮著重要作用。趙秋陽等[62]研究發(fā)現(xiàn),針刺CIRI模型大鼠的百會(huì)、四神聰穴后,其缺血半暗帶組織中SOD和GSH活性顯著升高,而Nrf2和p-Nrf2蛋白表達(dá)水平也顯著升高。杜韜等[63]研究也發(fā)現(xiàn),對(duì)腦梗死患者采取眼針八區(qū)8穴治療(以上焦區(qū)穴及下焦區(qū)穴作為主穴,以腎區(qū)穴、肝區(qū)穴作為配穴),治療2周后,結(jié)果發(fā)現(xiàn),眼針治療組患者的NQO1、ARE和Nrf2蛋白的表達(dá)水平顯著提高,Keap1蛋白的表達(dá)水平明顯降低。提示針刺干預(yù)可通過激活Nrf2/ARE通路中的關(guān)鍵蛋白(Nrf2、ARE、SOD和GSH蛋白)的表達(dá)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷的作用,對(duì)CIRI模型大鼠的神經(jīng)組織起到保護(hù)作用。

5.3 針刺治療與Ca2﹢/鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)/鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(calmodulin kinase Ⅱ, CaMKⅡ)信號(hào)通路

Ca2﹢/CaM/CaMKⅡ信號(hào)通路是一條體內(nèi)以 Ca2﹢變化來進(jìn)行調(diào)控的信號(hào)通路。當(dāng)體內(nèi)各種原因(如自由基O2﹣和 OH﹣的生成增多,谷氨酸和 NO的濃度升高)誘發(fā)Ca2﹢超載時(shí),高濃度的 Ca2﹢與 CaM結(jié)合,激活了下游鈣相關(guān)蛋白酶 CaMKⅡ,啟動(dòng)細(xì)胞死亡信號(hào)通路[64]。因此,CaMKⅡ及其底物變化參與缺血性神經(jīng)損傷。抑制CaMKⅡ過度激活對(duì)缺血早期神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[65],但過度抑制反而加重細(xì)胞損傷[66],這提示神經(jīng)細(xì)胞功能保護(hù)需要一定量 CaMKⅡ的活性維持。已有研究[67-68]表明,電針能調(diào)節(jié)腦缺血大鼠腦組織CaM及Ca2﹢濃度。但是針刺治療對(duì)CIRI機(jī)體CaMKⅡ的表達(dá)是否具有調(diào)控作用,至今未見報(bào)道。為此,針刺治療對(duì) CIRI Ca2﹢超載的調(diào)控作用是否通過 Ca2﹢/CaM/CaMKⅡ信號(hào)通路實(shí)現(xiàn),還有待研究。

5.4 針刺治療與腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/UNC51樣自噬激活激酶 1(UNC51-like autophagy activating kinase 1, ULK1)信號(hào)通路

AMPK是調(diào)控自噬起始階段的關(guān)鍵蛋白。CIRI會(huì)引發(fā)腦細(xì)胞的缺血、缺氧,進(jìn)一步引起腦細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯下降,導(dǎo)致AMP/ATP比例增高,從而激活A(yù)MPK信號(hào)通路,活化的AMPK通過激活TSC1/2復(fù)合物形成進(jìn)而抑制mTOR的活性,失活的mTOR進(jìn)一步抑制其下游ULK1的磷酸化,從而促進(jìn)自噬的發(fā)生[69]。AMPK還可以通過直接磷酸化Raptor蛋白來抑制mTOR的活性,促進(jìn)自噬的發(fā)生[70]。有研究[71]發(fā)現(xiàn),對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻閉模型小鼠在手術(shù)前給予針刺百會(huì)穴的干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺預(yù)處理可以促進(jìn)CIRI模型小鼠AMPK α蛋白的表達(dá),進(jìn)而通過抑制 CIRI模型小鼠腦組織缺血區(qū)的細(xì)胞凋亡來緩解CIRI的神經(jīng)損傷。Liu W等[72]的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),對(duì)CIRI鼠再灌注24 h時(shí)采用電針刺激曲池、足三里穴,能促進(jìn) CIRI小鼠 mTOR的蛋白表達(dá),抑制其 ULK1及Beclin1的蛋白表達(dá)。上述結(jié)果說明,針刺預(yù)處理或者直接干預(yù),能夠通過激活CIRI小鼠AMPK/mTOR/ULK1信號(hào)通路,從而抑制自噬蛋白Beclin1的表達(dá),進(jìn)而抑制 CIRI小鼠腦細(xì)胞的自噬反應(yīng)改善其神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙,發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。

6 討論

腦卒中是導(dǎo)致人類致殘和致死的主要疾病之一,其中約 87%為缺血性腦卒中。近年隨著人民生活方式轉(zhuǎn)變和人口老齡化加劇,缺血性腦卒中的發(fā)病率逐年升高并呈年輕化趨勢。重建血流或增強(qiáng)缺血區(qū)血流供應(yīng)是修復(fù)缺血性腦組織損傷的關(guān)鍵。但血流再灌注后腦組織損傷卻進(jìn)一步加重,其病理機(jī)制包括炎性反應(yīng)、自由基損傷、鈣超載等,當(dāng)前無較好的治療方法。因此,如何有效減輕CIRI已成為缺血性腦卒中治療的關(guān)鍵。

針刺作為一種有效的治療手段,在臨床中發(fā)揮著重要的作用,對(duì)于其療效以及機(jī)理的研究和探討具有非常重要的意義。本研究通過總結(jié)發(fā)現(xiàn),針刺對(duì)于CIRI具有良好的治療效果,其可能機(jī)制是通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白JAK2、STAT3等的表達(dá)來減輕炎性反應(yīng)和抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,從而減輕CIRI的神經(jīng)細(xì)胞損傷,發(fā)揮治療作用;還可能是通過激活 Nrf2/ARE信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白 HO-1和 NQO1來發(fā)揮抗氧化作用,減輕CIRI神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù);也可能是通過降低機(jī)體的Ca2﹢與CaM的含量來減緩CIRI的Ca2﹢超載,進(jìn)一步減輕氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮治療作用;還可能是通過激活A(yù)MPK/mTOR/ULK1來促進(jìn)mTOR和抑制ULK1的表達(dá),最終抑制自噬蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)進(jìn)而抑制CIRI鼠腦細(xì)胞的自噬反應(yīng)來改善其神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙,發(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)。但是,針刺治療對(duì)CIRI Ca2﹢超載的調(diào)控作用是否通過Ca2﹢/CaM/CaMKⅡ信號(hào)通路實(shí)現(xiàn),還有待深入研究。