Tim-3與胃癌腫瘤相關(guān)巨噬細胞的關(guān)系及艾灸調(diào)節(jié)作用的研究進展

徐靜,黃艷,,吳璐一,李昆珊,顧沐恩,馬喆,劉雅楠,鄭寒丹,黃儒德,劉慧榮,,李璟,吳煥淦,

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200437;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海200030;3.上海市氣功研究所,上海 200030)

胃癌的發(fā)病與幽門螺旋桿菌[1]、EB病毒[2]、遺傳因素[3](CDH1、CTNNA1等胃癌相關(guān)基因變異)和環(huán)境因素[4](高鹽、低果蔬飲食,吸煙)有關(guān),目前研究機制聚焦于胃細菌微生物群[5]、細胞外基質(zhì)[6]、microRNA[7]等對胃癌的作用。其中,T細胞免疫球蛋白及黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule 3, Tim-3)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中十分重要[8],調(diào)控 Tim-3在腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)上的表達,使TAMs由M2向M1型極化,有望成為腫瘤免疫治療的新方向[9-11]。目前胃癌的西醫(yī)療法主要依賴于外科手術(shù),術(shù)后行放療、化療、分子靶向治療,給患者帶來了巨大的經(jīng)濟負擔(dān),嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。中醫(yī)艾灸療法對胃癌有抑瘤、延長生存期、提高生活質(zhì)量和減輕化療不良反應(yīng)等作用,是一種有效的治療手段[12]。艾灸可激活巨噬細胞功能,提升巨噬細胞的吞噬能力及細胞毒作用,增加腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、白介素-1(interleukin-1, IL-1)等M1型巨噬細胞相關(guān)促炎抗腫瘤因子的分泌,發(fā)揮巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬、清除作用,或通過免疫檢查點分子Tim-3對巨噬細胞極化產(chǎn)生影響,發(fā)揮艾灸抗炎免疫、抗腫瘤的作用。本文對抑制性免疫檢查點分子Tim-3在胃癌患者TAMs極化調(diào)控作用以及艾灸治療胃癌的效應(yīng)機制進行探討,現(xiàn)報道如下。

1 Tim-3對胃癌患者TAMs極化調(diào)控作用

1.1 TAMs極化影響胃癌腫瘤的發(fā)生、發(fā)展

TAMs大量存在于腫瘤間質(zhì)細胞中,可分泌多種免疫抑制介質(zhì)以促進腫瘤的生長和遷移[13]。在腫瘤及腫瘤相關(guān)間質(zhì)細胞分泌的多種信號(CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL12、CXCL8、CSF-1、EMAP2、MMP-9、MMP-12)的誘導(dǎo)下,血液中的單核細胞被招募到腫瘤組織中,并在腫瘤微環(huán)境中的細胞因子作用下極化成為兩種不同類型的TAMs[14-15]。M1型經(jīng)典活化巨噬細胞和M2型替代活化巨噬細胞的生物學(xué)功能近乎拮抗[11,16]。M1型TAMs能釋放NO、ROS等腫瘤殺傷因子直接消滅腫瘤細胞[17],分泌 IL-1、IL-12、TNF-α等促炎因子刺激炎癥反應(yīng),高表達MHCⅠ、MHCⅡ發(fā)揮抗原提呈作用,對抗腫瘤免疫逃逸[18]。M2型巨噬細胞分泌VEGF、PDGF、MMP、TGF-β等促血管生成因子促進腫瘤組織血管新生,高表達 IL-10誘導(dǎo) Th2型免疫反應(yīng)以促進腫瘤免疫逃逸[19-20]。TAMs極化對慢性胃炎向胃癌發(fā)展有重要作用。M1型巨噬細胞在慢性胃炎的炎癥部位聚集,通過兩條途徑促使慢性胃炎向胃癌發(fā)展,①分泌TNF-α通過Wnt信號通路促進胃上皮組織惡變[21],②分泌 iNOS促使p53等抑癌基因突變,影響其表達,促進胃癌發(fā)展[22]。M2型TAMs數(shù)量在進展期胃癌中顯著增高,誘導(dǎo)ki67、MVD的高表達,促進腫瘤細胞增殖與血管新生,與預(yù)后呈負相關(guān)[23-24]。

進展期胃癌中,腫瘤微環(huán)境釋放的細胞因子能馴化TAMs向M2型極化,TAMs通過多種途徑抑制機體免疫,加速胃癌進展。①分泌TGF-β、IL-10等抑炎癥因子,抑制細胞表面 MHCⅡ類分子表達,減弱抗原提呈力,降低細胞毒作用。②分泌B7-H4[25]、可溶性FASL[26]、趨化因子CCL22[27-28]、刺激細胞凋亡蛋白酶-3活化[29],抑制CD4﹢T細胞活化、誘導(dǎo)CD8﹢T細胞凋亡、募集Treg細胞進入腫瘤組織,抑制T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。鑒于M1、M2型巨噬細胞近乎拮抗的生物學(xué)功能,有效調(diào)控M2型TAMs向M1型極化,是恢復(fù)巨噬細胞自身介導(dǎo)細胞毒作用,增強其抗原提呈能力,改善機體免疫抑制狀態(tài)的關(guān)鍵。

1.2 Tim-3調(diào)控胃癌巨噬細胞極化的相關(guān)機制

抑制性免疫檢查點分子Tim-3在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。Tim3是Tim家族中的重要成員,最初被作為區(qū)分Th1和Th2的特異性表面分子[30],能誘導(dǎo)T細胞凋亡,抑制Th1、Th17細胞功能,促進Th1細胞凋亡,負性調(diào)節(jié)機體免疫[31]。深入研究發(fā)現(xiàn),Tim3還參與巨噬細胞極化的調(diào)控,其高表達會促使巨噬細胞向M2型極化,抑制炎癥因子的分泌。Tim-3在M2型巨噬細胞上的表達水平遠高于M1,且過表達Tim-3能降低M1型巨噬細胞的免疫應(yīng)答,減弱炎性癥狀,而抑制Tim-3表達則會激活巨噬細胞的促炎功能,加重炎性癥狀[9,32-33]。Tim-3高表達于多種惡性腫瘤的TAMs中,Tim-3﹢TAMs的浸潤程度和極化狀態(tài),與腫瘤的發(fā)生和遷移高度相關(guān)[34-35]。研究發(fā)現(xiàn),肝癌、結(jié)腸癌中Tim-3過表達能誘導(dǎo)TAMs的M2型極化,伴隨M2型TAMs相關(guān)分子Arg-1、CD206、IL-10的高表達及M1型相關(guān)分子TNF-α的低表達,抑制機體免疫功能,促進腫瘤生長,抑制Tim-3表達能調(diào)控M2型TAMs向M1型極化,免疫抑制分子表達下降,從而抑制腫瘤生長[36-37]。STATS家族在巨噬細胞極化調(diào)控中起重要作用。STAT1參與 M1型極化調(diào)控,STAT6參與M2型極化[38-39]。Tim-3可影響以上這些因子的表達,形成巨噬細胞極性調(diào)控的信號通路。①Tim-3/STAT6,在腫瘤微環(huán)境中IL-3、IL-4分別與它們的受體結(jié)合,激活STAT6磷酸化,導(dǎo)致STAT6移位至細胞核,激活 M2巨噬細胞特異性靶基因的轉(zhuǎn)錄,例如CD206、Arg-1等[40]。阻斷Tim-3可使巨噬細胞中STAT-6磷酸化水平顯著降低,伴隨M2型巨噬細胞減少,Arg-1、CD206表達降低,有效抑制巨噬細胞 M2極化[36]。②Tim-3/STAT1/miR-155,STAT1可上調(diào) microRNA miR-155的表達[41],miR-155降解SOCS1、C/EBPβ等目的蛋白mRNA,降低SOCS1、C/EBPβ的表達水平,SOCS1、C/EBPβ是抑制 M1極化、促進 M2極化的關(guān)鍵分子。Tim-3能招募STAT1進入腫瘤組織并與之結(jié)合,從而抑制STAT1活化及入核,降低miR-155的轉(zhuǎn)錄水平,進而上調(diào)SOCS1的表達,導(dǎo)致Arg-1和IL-10表達增加,促進巨噬細胞的M2型極化[37]。詳見圖1。

圖1 Tim-3調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化的途徑

2 艾灸治療胃癌的效應(yīng)及其相關(guān)機制

2.1 艾灸治療胃癌的效應(yīng)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腫瘤的病理性質(zhì)屬本虛標(biāo)實,或因邪致虛,最終正虛邪實。癌毒作為一種特殊毒邪,是腫瘤發(fā)生的特異致病因素。腫瘤具有損耗正氣、釀生痰瘀的致病特性。痰、毒、瘀等病理產(chǎn)物交融夾雜,導(dǎo)致痰毒內(nèi)結(jié),氣滯濕蘊,瘀血內(nèi)阻,津液代謝異常,癌病乃成。艾灸對胃癌的輔助治療效果已得到公認(rèn),諸多研究表明艾灸不僅能減緩瘤體生長速度、縮小實體瘤體積,對胃癌術(shù)后恢復(fù)及緩解放化療不良反應(yīng)亦有顯著效果。溫和灸能提高胃癌患者免疫功能[41],緩解晚期胃癌患者癌痛[42],促進胃癌術(shù)后胃腸功能恢復(fù),縮短患者排氣時間,減少術(shù)后并發(fā)癥,提高患者生活質(zhì)量[43-45];抑制荷瘤大鼠瘤體生長,促進腫瘤細胞凋亡,減少血管增生[46-47]。隔藥灸、化膿灸能有效緩解胃癌患者化療引起的惡心、嘔吐、乏力及骨髓抑制癥狀[48-50],此外,隔藥灸能改善消化道腫瘤術(shù)后胃癱的臨床癥狀,縮短胃管留置時間[51]。雷火灸可有效緩解胃癌患者化療后疲乏癥狀[52]。麥粒灸能改善胃癌患者化療后骨髓抑制癥狀,降低進展期胃癌患者血小板數(shù)量、改善患者高凝狀態(tài),減輕胃癌患者的臨床癥狀,如疲乏、睡眠困難以及消化系統(tǒng)的惡心嘔吐、食欲減退、腹脹、便秘等,對胃癌術(shù)后胃癱綜合征亦有顯著療效,在提高患者生活質(zhì)量、延長生存期方面有重要作用[53-56]。

2.2 艾灸治療胃癌的相關(guān)機制

艾灸具有“疫苗樣效應(yīng)”,能調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境,促進免疫細胞的增殖和活化,參與固有免疫及適應(yīng)性免疫,從而影響免疫相關(guān)細胞因子的分泌,實現(xiàn)臟腑和整體的免疫調(diào)節(jié),能有效對抗腫瘤免疫逃逸,發(fā)揮抗腫瘤作用。其中,直接灸/麥粒灸因貼于皮膚表面燃燒,熱力深透腧穴部位,對皮膚產(chǎn)生的灼痛感還可激發(fā)人體疼痛反應(yīng)機制,并通過“創(chuàng)傷-炎癥-修復(fù)”刺激機體產(chǎn)生異體蛋白,進一步提升機體免疫力,達到治療腫瘤的目的[57-58]。

2.2.1 艾灸對巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用

巨噬細胞受腫瘤微環(huán)境影響極化為M2型,其吞噬能力及細胞毒作用受到抑制,表現(xiàn)為免疫抑制狀態(tài)。目前尚缺乏艾灸對胃癌相關(guān)巨噬細胞極化調(diào)節(jié)的研究,但在其他類型的腫瘤中,艾灸對于巨噬細胞功能的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)得到證實。艾灸可提升巨噬細胞的吞噬能力及細胞毒作用,增加TNF-α、NO、IL-1等M1型巨噬細胞相關(guān)促炎抗腫瘤因子的分泌,發(fā)揮巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬、清除作用。饒本強等[59]對艾灸的抑瘤作用及機制進行初步探索,發(fā)現(xiàn)艾灸組的巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)均顯著高于對照組,表明艾灸可激活巨噬細胞活性,艾灸關(guān)元穴對荷瘤小鼠移植瘤的生長有明顯的抑制作用,且艾灸組腫瘤細胞壞死面積更廣泛、分化程度更高,表明艾灸組巨噬細胞的吞噬活力增高,機體免疫功能提高,艾灸的抑瘤作用與其能提高機體免疫功能有關(guān)。楊志新等[60-61]發(fā)現(xiàn),小鼠荷瘤后巨噬細胞吞噬功能顯著降低,M1型巨噬細胞相關(guān)分子TNF-α、NO的分泌水平顯著下降,艾灸干預(yù)能顯著抑制瘤體生長,能顯著提升巨噬細胞吞噬率、吞噬指數(shù)及殺傷活性,并提高TNF-α、NO的分泌水平。此外,實驗研究表明,艾灸通過增強巨噬細胞吞噬能力改善腫瘤化療后機體免疫抑制狀態(tài)。采用環(huán)磷酰胺化療后的小鼠免疫功能受到抑制,艾灸大椎穴對免疫功能低下小鼠的巨噬細胞吞噬功能具有顯著的增強作用,改善免疫低下狀態(tài),提高小鼠非特異性免疫功能[62-63]。麥粒灸治療可顯著提升環(huán)磷酰胺化療后小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)的表達。GM-CSF能提升巨噬細胞活性,增強其吞噬作用,提高其抗原提呈能力[64]。艾灸對巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用不僅體現(xiàn)在腫瘤中,研究表明在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[65]、腹腔急性感染[66]及免疫抑制病理狀態(tài)下[67],艾灸大椎、中脘等穴可顯著增加巨噬細胞的數(shù)量、吞噬指數(shù)、吞噬率及細胞毒作用且免疫抑制模型動物的效果顯著優(yōu)于正常機體。

2.2.2 艾灸對 M1/M2型巨噬細胞相關(guān)細胞因子的調(diào)控作用

艾灸可增強IL-12、TNF-α等M1相關(guān)促炎因子分泌,刺激機體免疫功能。IL-12可增強T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤效果。麥粒灸可增加 IL-12在腫瘤化療患者外周血中的表達[68]。TNF-α能直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性,是高效抗腫瘤因子。TNF-α可降低溶酶體穩(wěn)定性,促使酶外泄,細胞溶解[69];能激活磷脂酶 A2,釋放超氧化物引起DNA斷裂[70];能促進靶細胞糖酵解,降低細胞內(nèi)pH值,擾亂代謝直接殺傷腫瘤細胞[71]。對胃荷瘤大鼠進行艾灸干預(yù)發(fā)現(xiàn),艾灸組大鼠 TNF-α含量較模型組顯著增加,提示艾灸通過增強 TNF-α的分泌抑制胃癌腫瘤的生長[72]。M2型巨噬細胞分泌的IL-10、VEGF能促進腫瘤組織血管新生。IL-10具有免疫抑制作用,是腫瘤免疫逃逸的機制之一。研究發(fā)現(xiàn),胃癌模型大鼠癌組織IL-10明顯增高,隔姜灸干預(yù)后胃癌組織IL-10含量較胃癌模型大鼠明顯降低,隔姜灸可能通過降低大鼠胃癌組織中IL-10含量而達到治療胃癌的目的[73]。VEGF是一類具有高度特異性的癌細胞生成作用細胞因子,能促進腫瘤微小血管的形成和延伸。動物實驗發(fā)現(xiàn),胃荷瘤大鼠胃組織中VEGF含量顯著增加,溫和灸足三里能顯著降低 VEGF含量,溫和灸可能通過抑制 VEGF分泌,加速胃癌組織缺血壞死[74]。

2.2.3 艾灸通過JAK1/STAT5途徑調(diào)控巨噬細胞功能抗腫瘤

艾灸能顯著提高胃癌小鼠 JAK1、STAT5的表達,JAK1/STAT5通路的激活調(diào)控相關(guān)基因表達并發(fā)揮抗腫瘤作用[75]。研究表明,STAT5的活化可促進miR-155的轉(zhuǎn)錄[76]。miR-155是巨噬細胞M1型極化的關(guān)鍵因子,推測麥粒灸的抗腫瘤作用或與M1型極化有關(guān)。

2.2.4 艾灸對T細胞的調(diào)控作用

對胃癌化療患者進行艾灸治療能顯著提高患者CD3﹢T細胞、CD4﹢T細胞含量,下調(diào)細胞毒性CD8﹢T細胞含量,提高CD4﹢T/CD8﹢T比值,抑制淋巴細胞凋亡,提高腫瘤患者的淋巴細胞轉(zhuǎn)化率,改善免疫抑制狀態(tài),起到抗腫瘤效果[77-79]。

2.2.5艾 灸對NK細胞及NLR的調(diào)控作用

NK細胞對腫瘤細胞具有直接殺傷作用[80-81],且活化的NK細胞具有更顯著的腫瘤清除作用[82-83],因而增強 NK細胞的含量及其殺傷活性對防治腫瘤具有重要意義。艾灸對胃癌患者 NK細胞數(shù)量具有顯著提升作用[71-72],且在動物實驗中得到驗證,胃癌荷瘤大鼠模型組比較,艾灸組大鼠干預(yù)中、后期體質(zhì)量,食量增加,NK細胞數(shù)量顯著增加,表明艾灸能增加胃癌SD大鼠體質(zhì)量,恢復(fù)食量,改善胃癌大鼠狀態(tài),其機制可能與NK細胞含量增加,細胞免疫增強有關(guān)[47]。中性粒細胞-淋巴細胞比率(neutrophil to lymphocyte ratio, NLR)是胃癌預(yù)后的獨立相關(guān)性的炎性指標(biāo)。高NLR患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、遠處轉(zhuǎn)移率高,總生存期短,預(yù)后較差[84-85]。麥粒灸足三里及胃俞能降低進展期胃癌患者NLR水平,改善胃癌患者免疫功能,提升生命質(zhì)量[86]。

3 討論

國內(nèi)外艾灸研究已論證了其輔助治療胃癌的作用,主要集中在抑瘤作用、調(diào)高機體免疫力、改善化療后骨髓抑制及臨床癥狀,在一定程度上指導(dǎo)了臨床艾灸抗腫瘤的實踐。艾灸療法的“疫苗樣效應(yīng)”抗腫瘤機制尚處于探索階段。艾灸輔助治療胃癌可提高巨噬細胞的吞噬能力,這項研究成果初步揭示了艾灸抑制胃癌腫瘤生長的機制。近年來,Tim-3對腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化調(diào)節(jié)作用越來越被重視,艾灸對胃癌患者穴位的局部刺激,或可通過調(diào)節(jié)局部穴區(qū)、低級中樞和高級中樞、遠端靶器官胃癌組織中Tim-3的異常表達,影響腫瘤相關(guān)巨噬細胞由M2型向M1型極化,發(fā)揮抗炎免疫和抗腫瘤的作用,達到改善胃癌患者的臨床癥狀、體征,提高生活質(zhì)量之目的。今后研究方向可聚焦胃癌組織中作用于腫瘤相關(guān)巨噬細胞的 Tim-3生物學(xué)功能,探索Tim-3作為免疫檢查點分子在艾灸治療胃癌患者潛在的抗腫瘤機制?；诎呐R床治療胃癌有效,可從組織水平、細胞水平、體內(nèi)水平的不同層面,研究艾灸調(diào)節(jié)胃癌 Tim-3的異常表達,繼而調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細胞M2向M1極化。臨床募集胃癌患者及健康體檢者,對胃癌患者進行艾灸干預(yù),采集艾灸前后胃癌患者血清及健康體檢者血清,比較健康狀態(tài)及艾灸前后Tim-3、M1/M2巨噬細胞數(shù)量及M1/M2巨噬細胞相關(guān)分子 TNF-α、IL-1、IL-2、IL-12、TGF-β分泌水平的變化。制備胃癌大鼠模型并分為正常組、模型組、艾灸組、西藥組,比較不同組間瘤體變化,M1/M2巨噬細胞相關(guān)分子 TNF-α、IL-1、IL-2、IL-12、TGF-β分泌水平的變化,觀察血清、癌組織及癌旁單核巨噬細胞Tim-3的表達水平。探索Tim-3/STAT1/miR-155途徑對巨噬細胞極化的調(diào)控作用,制備胃癌大鼠模型并分為正常組、模型組、艾灸組、西藥組,檢測黏膜組織Tim-3、STAT1、p-STAT1表達,比較不同分組的巨噬細胞中Tim-3、STAT1及miR-155表達差異。另一方面,今后研究可探討 Tim-3在癌前病變慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)中的具體作用,一般認(rèn)為胃癌沿“慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃腺癌”方向發(fā)展[87],CAG作為胃癌前疾病,與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),明確Tim-3在艾灸治療CAG中主要的抗炎免疫機制,完善艾灸對CAG、胃癌抗炎免疫和抗腫瘤作用的理論基礎(chǔ),明確艾灸糾正 CAG胃黏膜組織形態(tài)學(xué)改變,可阻遏胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用,提高艾灸治療 CAG、胃癌的療效,促進其在臨床上的進一步應(yīng)用。