淋巴細(xì)胞亞群在鼻咽癌高癌家系外周血中的臨床意義

蘭炎根, 陳舒華, 李嘉, 黎雄文, 鄧曄

全世界約80%的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)發(fā)生于我國,特別是廣東、廣西等地,好發(fā)于各年齡段[1-3]。NPC還表現(xiàn)為家族聚集現(xiàn)象,具有NPC發(fā)病家族史的人發(fā)生NPC的概率較高,且遺傳因素在黃種人和白種人中均表現(xiàn)明顯,特別NPC患者的一級親屬(包括患者父母,同胞兄妹及子女)表現(xiàn)更明顯[4-7]。外周血淋巴細(xì)胞亞群在病毒感染、自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、再生障礙性貧血、胃癌中都有異常改變,通過對TBNK淋巴細(xì)胞亞群分析,可以了解細(xì)胞免疫狀態(tài),進(jìn)而對臨床診治提供一定依據(jù)[8-9]。S100-A9在食管癌、膀胱癌、胃癌等細(xì)胞運(yùn)動、分化及轉(zhuǎn)移等中發(fā)揮著重要作用。目前，淋巴細(xì)胞亞群在NPC高癌家系外周血中的臨床意義研究報道較少。本研究對我院NPC高癌家系NPC患者外周血淋巴細(xì)胞亞群與S100-A9進(jìn)行了檢測和分析,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 以2016年1月至2019年3月梅州市人民醫(yī)院門診收治的60例高癌家系NPC患者為A組,NPC高癌家系中成員68人為B組,同期在我院進(jìn)行體檢的健康人員70人為C組。A組男48例,女12例;年齡28～52歲,平均(47.32±9.86)歲;A組患者均經(jīng)病理活檢確診為NPC且其家族中已有至少2個一級親屬確診為鼻咽癌,即該組患者均為NPC高癌家系NPC患者,所有患者在接受檢查前未進(jìn)行化療、放療等腫瘤治療。B組男52人,女16人;年齡15～78歲,平均(42.61±8.76)歲,均為高癌家系NPC一級親屬,但未發(fā)生NPC。C組男54人,女16人;年齡28～54歲,平均(48.73±9.24)歲。3組受驗(yàn)者均已簽署知情同意書，基本資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得梅州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法 采集3組受驗(yàn)者靜脈血液標(biāo)本2管,1管使用Ficoll分層液(北京索萊寶科技有限公司,產(chǎn)品貨號: P8900)法分離各組外周血單核細(xì)胞后,采用流式檢測分析TBNK細(xì)胞亞群，并動態(tài)觀察;1管在無菌條件下以同樣方法分離淋巴細(xì)胞,再分別抽提細(xì)胞總蛋白,保證標(biāo)本無污染,處理后立即入液氮中保存?zhèn)溆?。抽提出蛋白質(zhì),應(yīng)用Western-blot方法對鈣調(diào)蛋白S100-A9進(jìn)行驗(yàn)證分析。對比3組淋巴細(xì)胞亞群與S100-A9含量,并分析其意義。

Ficoll分層液法:采集患者血液后,加入放有肝素液的無菌試管內(nèi),然后加入等量的生理鹽水稀釋;將稀釋后的血液加入人淋巴細(xì)胞分離專用插管,在水平離心機(jī)中離心25 min,液體從上向下分別為血清層、白膜層、淋巴液層、紅細(xì)胞層,取出白膜層即是我們需要的外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。

流式分析:使用無菌生理鹽水清洗分離后的PBMC,分別使用流式專用TBNK細(xì)胞抗體(上海艾博抗體有限公司)在4 ℃冰箱孵育30 min,無菌生理鹽水再次清洗,并設(shè)立對照(分離后的PBMC,但不加TBNK抗體)。使用流式檢測儀進(jìn)行分析。

Western-blot法:提取PBMC中蛋白;使用SDS-PDAG電泳凝膠跑樣;將樣品條帶轉(zhuǎn)至NC膜上;孵育一抗4 ℃過夜;孵育二抗室溫下2 h;PBS清洗后,發(fā)光顯示蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 外周血TBNK細(xì)胞含量對比 A組患者外周血中CD3+(T)細(xì)胞、CD4+(T)細(xì)胞、CD19+(B)細(xì)胞、CD56+(NK)細(xì)胞明顯低于B組和C組,而CD8+(T)細(xì)胞明顯高于B組和C組;B組受驗(yàn)者外周血中CD3+、CD4+、CD19+、CD56+細(xì)胞明顯低于C組,而CD8+明顯高于C組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

表1 3組受驗(yàn)者外周血TBNK細(xì)胞含量對比

2.2 外周血S100-A9對比 Western Bloting檢測顯示A組S100-A9蛋白表達(dá)量明顯高于B組和C組;B組患者S100-A9蛋白表達(dá)量明顯高于C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3 A組患者治療前后外周血淋巴細(xì)胞及S100-A9對比 A組患者經(jīng)過治療后,患者外周血中CD3+、CD4+、CD19+、CD56+細(xì)胞明顯高于治療前,而CD8+明顯低于治療前(見表2);A組患者S100-A9蛋白表達(dá)量明顯低于治療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 A組患者治療前后外周血淋巴細(xì)胞對比

3 討論

鼻咽癌發(fā)病表現(xiàn)出明顯的家族聚集現(xiàn)象,中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院分析了1 142例鼻咽癌患者的病例資料,高達(dá)21.9%的患者具有腫瘤家族史[8];Albeck等[9]報道1980—1990年之間格林蘭島上的愛斯基摩人有48人被診斷為鼻咽癌,其中7例具有鼻咽癌家族史,發(fā)生率14.6%;凌啟南等[10]報道1 163例鼻咽癌家族史調(diào)查結(jié)果,發(fā)現(xiàn)93例鼻咽癌有高癌家系,發(fā)生率為8.0%;有報道顯示，375例鼻咽癌中25例具有鼻咽癌家族史,發(fā)生率為6.61%[11];Levine等[12]還報道了一些白種人的鼻咽癌高癌家系,同時其發(fā)現(xiàn)了17例發(fā)生于非中國人的其他國家及種族的病例,雖然他未能統(tǒng)計出其發(fā)生率,但根據(jù)其他種族的發(fā)病率,足以表明遺傳因素在各個種族的鼻咽癌發(fā)病上都具有不可忽視的作用。根據(jù)我們的研究資料并結(jié)合文獻(xiàn)可知，鼻咽癌高癌家系的發(fā)生率大概占總鼻咽癌發(fā)病數(shù)的7.7%，因此,早發(fā)現(xiàn)、早診斷對鼻咽癌高癌家系患者的治療和預(yù)后具有深遠(yuǎn)的意義。外周血淋巴細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞亞群、NK淋巴細(xì)胞亞群)是檢測機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo),對疾病的早期診斷和治療具有重要意義[13-14]。S100-A9蛋白是以細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化為中介信號,進(jìn)而對鈣離子結(jié)合蛋白起到激動和移植的作用,它可能在NPC家系NPC發(fā)生過程中具有重要作用[15]。

本研究檢測外周血中TBNK細(xì)胞水平及S100-A9含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),A組患者免疫功能明顯低于B組和C組,B組受驗(yàn)者免疫功能明顯低于C組,說明NPC患者的免疫功能較低,對其TBNK細(xì)胞水平進(jìn)行檢測可能有助于對患者病情的早期診斷。A組患者S100-A9水平明顯高于B組和C組受驗(yàn)者,B組受驗(yàn)者S100-A9水平明顯高于C組,說明S100-A9水平與是否會發(fā)生NPC具有一定的相關(guān)性。本研究鑒于其他疾病中外周血淋巴細(xì)胞亞群與S100-A9水平較高,提出這一現(xiàn)象可能在NPC患者中也存在,具有一定的創(chuàng)新性,能給臨床提供一定的依據(jù)。但由于樣本量較小,技術(shù)水平等限制,研究結(jié)果在數(shù)據(jù)方面可能存在一些偏差,研究深度也需進(jìn)一步加強(qiáng)。

綜上所述,檢測外周血TBNK細(xì)胞及S100-A9蛋白水平能夠區(qū)分NPC高癌家系患者、NPC高癌家系成員及正常人群；高癌家系NPC患者治療后TBNK細(xì)胞及S100-A9蛋白水平變化明顯,可作為NPC風(fēng)險預(yù)測和治療效果評估的指標(biāo)。