miR-122抑制Sprouty2促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖

周海, 潘凱, 陳玉明, 申余勇, 周明, 賀興軍, 費(fèi)尚春, 王小祥

微小RNAs(mircoRNAs, miRNAs)是一種由21～22個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼RNA,可以通過(guò)與靶基因3′-非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,從而抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明miRNAs參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1]。Sprouty2屬于哺乳動(dòng)物Sprouty信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白家族,在細(xì)胞凋亡、增殖、遷移中發(fā)揮重要的作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-122在腎癌中的作用,并確定Sprouty2是否是miR-122的作用靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 原發(fā)性腎癌和相鄰正常組織標(biāo)本來(lái)自揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1月至2019年6月接受部分或根治性腎切除術(shù)的患者,共42例,中位年齡55歲(41～70歲)。組織標(biāo)本于術(shù)后立即在液氮中冷凍,并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。選取腫瘤組織>70%的樣品用于提取總RNA。本研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核,并取得所有患者及家屬書(shū)面知情同意。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 CAKI-1、786-0細(xì)胞系、放射免疫沉淀測(cè)定緩沖液(南京凱基生物公司),Lipofectamine 2000TM試劑、Trizol試劑(上海英俊生物公司),轉(zhuǎn)染序列(上海吉瑪公司),Sprouty2和 GAPDH基因序列(上海捷瑞生物),NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó)),TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan MicroRNA Assay Kit及 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司,美國(guó)),PrimerScript One-Step RT-PCR試劑盒(大連Takara公司),PVDF膜(Millipore公司,美國(guó)),抗β微管蛋白、小鼠抗Sprouty2(Abcam公司,美國(guó)),化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司,美國(guó)),細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)(上海碧云天生物技術(shù)公司),pGL3-REPORT熒光素酶載體試劑盒(Invitrogen公司,美國(guó)),雙熒光素酶測(cè)定法(Promega公司,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)使用了CAKI-1和786-0兩種人類細(xì)胞系。細(xì)胞在包含有10%胎牛血清(FBS)、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640和McCoy’s 5A培養(yǎng)基中,于含有5%CO2的37 ℃環(huán)境培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前1天將細(xì)胞接種在6孔板上,細(xì)胞生長(zhǎng)密度約70%時(shí)使用LipofectamineTM2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后,用RPMI-1640/McCoy’s 5A和FBS代替培養(yǎng)基。miR-122 模擬序列為:上游引物5′-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3′;下游引物5′-AACACCAUUGUCACACUCCAUU-3′。miR-122 對(duì)照序列為:上游引物5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′;下游引物5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。miR-122 抑制劑序列為:5′-CAAACACCAUUGUCACACUCCA-3′;miR-122 抑制劑對(duì)照序列為:5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。靶向作用于Sprouty2的小干擾RNA(siRNA)序列為:上游引物5′-CCCAGCAGGUACAUGUCUUTT-3′;下游引物5′-AAGACAUGUACCUGCUGGGTT-3′。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè) 根據(jù)說(shuō)明書(shū),使用Trizol試劑從組織和細(xì)胞中提取總RNA,用NanoDrop測(cè)量RNA濃度。使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 反轉(zhuǎn)錄得到miR-122的互補(bǔ)DNA(cDNA),根據(jù)使用說(shuō)明將總RNA(10ng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用TaqMan MicroRNA Assay Kit行PCR操作。內(nèi)參U6探針序列為cat:4395356。使用PrimerScript One-Step RT-PCR Kit將Sprouty2 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Sprouty2引物序列:正向引物 5′-ATCCAGAGACAAGACATGTAC-3′,反向引物5′-TTCAGATGTGTTCTAAGCC-3′; 而GAPDH的序列為:正向引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,反向引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。所有反應(yīng)均使用7900HT Fast Real-Time PCR System進(jìn)行3次。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western bolt檢測(cè) 采用radioimmunoprecipitation assay buffer,加入蛋白酶抑制劑,提取細(xì)胞系和腎癌組織蛋白。應(yīng)用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;然后用5%脫脂牛奶在PBST中封閉1 h。在4 ℃下與一抗anti-β-tubulin和 anti-Sprouty2孵育過(guò)夜后,用TBST洗滌3次,常溫下二抗孵育2 h,檢測(cè)條帶。上述每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定腎癌細(xì)胞體外增殖水平 細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種在96孔板中。在分別轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h和96 h后,進(jìn)行CCK-8測(cè)定。每個(gè)處理組3組樣品,測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處吸光度來(lái)確定細(xì)胞存活率。

1.2.5 流式細(xì)胞法測(cè)定腎癌細(xì)胞體外細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞,用PBS洗滌兩次,并在-20 ℃下用70%乙醇固定過(guò)夜。然后常溫下將細(xì)胞在50 mg/ml碘化丙啶和1 mg/ml RNA酶中孵育30 min。使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。每個(gè)樣品至少包含20 000個(gè)細(xì)胞。上述每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定Sprouty2基因表達(dá)水平 將含有miR-122結(jié)合位點(diǎn)的野生型Sprouty2 3′-UTR和突變型Sprouty2 3′-UTR的片段克隆至pGL3熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。構(gòu)建含有Sprouty2 3′-UTR和突變型Sprouty2 3′-UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒;miR-122類似物、miR-122類似物對(duì)照和miR-122抑制劑、miR-122抑制物對(duì)照共轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染48 h后,以內(nèi)參基因作為內(nèi)參照,雙熒光素酶測(cè)定法測(cè)量熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-122和Sprouty2在腎癌中的表達(dá)水平

使用RT-qPCR分析42個(gè)原發(fā)性腎癌和42個(gè)正常組織標(biāo)本中miR-122的表達(dá)水平。腎癌組織中miR-122的表達(dá)水平高于正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。Western bolt顯示Sprouty2蛋白在腎癌組織中的表達(dá)水平低于正常對(duì)照組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。MiR-122與Sprouty2在腎癌中表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

注:N代表正常組織,T代表癌組織與癌組織比較,*P<0.05

注:N代表正常組織,T代表癌組織;與癌組織比較,*P<0.05

2.2 下調(diào)miR-122對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的影響

在786-0和CAKI-1細(xì)胞中，通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-122 抑制劑及miR-122抑制劑對(duì)照研究miR-122對(duì)細(xì)胞增殖的影響。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中,miR-122表達(dá)下調(diào)96 h后腎癌細(xì)胞的體外增殖活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3A)。與陰性對(duì)照和空白組相比,miR-122抑制劑轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細(xì)胞在G0/G1期的百分比升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明下調(diào)miR-122可引起細(xì)胞停滯在G1期(圖3B), miR-122在體外實(shí)驗(yàn)中增強(qiáng)了腎癌細(xì)胞的增殖能力。

3A:786-0和CAKI-1細(xì)胞不同干預(yù)的增殖能力;3B:miR-122抑制劑轉(zhuǎn)染導(dǎo)致786-0和CAKI-1細(xì)胞G1細(xì)胞周期停滯，與陰性對(duì)照和空白組相比,*P<0.05

2.3 miR-122抑制劑與Sprouty2表達(dá)量的關(guān)系

與陰性對(duì)照和空白組相比,用miR-122抑制劑轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細(xì)胞中miR-122的表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4A)。3組間Sprouty2 mRNA表達(dá),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4B),轉(zhuǎn)染72 h后,轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑的細(xì)胞中Sprouty2蛋白的表達(dá)高于陰性對(duì)照組、空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4C)。miR-122能下調(diào)Sprouty2蛋白的表達(dá)水平。

4A:miR-122抑制劑轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細(xì)胞中miR-122的表達(dá),與陰性對(duì)照和空白組相比,*P<0.05;4B:轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑對(duì)細(xì)胞Sprouty2 mRNA的影響;4C:轉(zhuǎn)染miR-122抑制劑對(duì)細(xì)胞中Sprouty2蛋白表達(dá)的影響

2.4 敲低Sprouty2對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的影響

Sprouty2蛋白和mRNA的表達(dá)量在si-Sprouty2轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細(xì)胞中低于用對(duì)照組siRNA或空白組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5A、5B)。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中,用si-Sprouty2轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細(xì)胞增殖能力相比對(duì)照組、空白組的細(xì)胞增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖6A)。轉(zhuǎn)染48 h后,用si-Sprouty2轉(zhuǎn)染的CAKI-1和786-0細(xì)胞與對(duì)照和空白組細(xì)胞相比,G1期細(xì)胞百分比減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖6B)。敲低Sprouty2增強(qiáng)了腎癌細(xì)胞的體外增殖能力。

5A:Sprouty2敲低對(duì)體外細(xì)胞Sprouty2 mRNA表達(dá)的影響,與陰性對(duì)照和空白組相比，*P<0.05;5B:Sprouty2敲低對(duì)體外細(xì)胞Sprouty2蛋白表達(dá)的影響

6A:Sprouty2敲低對(duì)細(xì)胞增殖的影響;6B:Sprouty2敲低對(duì)細(xì)胞G1期的影響,與陰性對(duì)照和空白組相比，*P<0.05

2.5 Sprouty2與miR-122的靶向關(guān)系

野生型Sprouty2在其3′-UTR中包含miR-122可能的結(jié)合位點(diǎn)(圖7A)。兩種細(xì)胞系中,用miR-122類似物共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶基因表達(dá)水平低于和用miR-122類似物對(duì)照或miR-122抑制劑對(duì)照轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶基因表達(dá)水平;與miR-122抑制劑的共轉(zhuǎn)染增強(qiáng)了熒光素酶基因的活性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖7B)。突變型Sprouty2在3′-UTR中亦包含miR-122可能的結(jié)合位點(diǎn)(圖8A)，但是含有突變型Sprouty2 3′-UTR的報(bào)告,基因組間相關(guān)熒光素酶基因活性,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖8B)。因此,miR-122是腎癌細(xì)胞系中Sprouty2的直接靶基因。

注:與陰性對(duì)照組相比,*P<0.05;與抑制劑陰性對(duì)照組相比,*P<0.05。7A:miR-122與野生型Sprouty2 3′-UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn);7B:786-0和CAKI-1細(xì)胞株,與miR-122類似物或miR-122 抑制劑組共轉(zhuǎn)染對(duì)熒光素酶基因活性的影響

注:與陰性對(duì)照組、抑制劑陰性對(duì)照組相比,P>0.05。8A:miR-122與突變型Sprouty2 3′-UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn);8B:786-0和CAKI-1細(xì)胞株,與miR-122類似物或miR-122 抑制劑組共轉(zhuǎn)染對(duì)熒光素酶基因活性的影響

3 討論

腎癌是一種常見(jiàn)的泌尿系腫瘤,最常見(jiàn)的亞型是透明細(xì)胞癌[4]。目前腎癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確,其高危因素包括吸煙、肥胖、高血壓和糖尿病等[5]。由于臨床缺乏腎癌的早期診斷標(biāo)志物,患者確診時(shí)腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的比例相當(dāng)高。因此,研究與腎癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制可為腎癌的臨床診斷、治療提供更多依據(jù)。

miR-122由肝臟特異性產(chǎn)生,它參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞發(fā)育、分化、膽固醇代謝和應(yīng)激反應(yīng),并抑制肝細(xì)胞癌發(fā)生[6]。研究表明miR-122在乳腺癌和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中存在異常表達(dá)[7-8]。Osanto等[9]發(fā)現(xiàn)miR-122在腎癌中過(guò)度表達(dá),提示miR-122可能是腎癌的診斷標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。Sprouty2通過(guò)抑制Ras/促分裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路[10],調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和細(xì)胞凋亡,參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。目前miR-122與Sprouty2相關(guān)性仍不清楚,因此,我們期望明確miR-122在腎癌中的作用機(jī)制并進(jìn)一步研究Sprouty2與miR-122的相關(guān)性,為腎癌臨床早期檢測(cè)和靶向治療提供參考。

本研究中發(fā)現(xiàn)miR-122在腎癌組織樣本中表達(dá)水平相對(duì)相鄰正常組織升高,這與其他miR-122在腎癌中表達(dá)水平研究結(jié)果一致[9]。近期越來(lái)越多的證據(jù)表明[11],miR-122在腫瘤中發(fā)揮不同作用。在肝癌中,誘導(dǎo)miR-122表達(dá)抑制Bcl-W和/或細(xì)胞周期蛋白 CyclinG1(CCNG1)的表達(dá),引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[12]。此外,乳腺癌中miR-122的表達(dá)上調(diào)能靶向作用IGF1R,同時(shí)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/Mtor/p70s6k通路來(lái)抑制腫瘤發(fā)生[13]。這些發(fā)現(xiàn)表明miR-122在肝癌和乳腺癌中起到抑癌作用。然而,miR-122在進(jìn)展性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)升高,證明miR-122在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤中起致癌作用[14]。我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-122抑制786-0和CAKI-1細(xì)胞系的增殖、侵襲和遷移,表明miR-122在腎癌細(xì)胞系中發(fā)揮致癌作用。明確參與miR-122調(diào)控的靶點(diǎn)可以進(jìn)一步明確miR-122的作用機(jī)制。我們認(rèn)為Sprouty2是miR-122的潛在靶點(diǎn)。首先,我們確定了Sprouty2的3′-UTR中有miR-122序列的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。與miR-122抑制劑對(duì)照相比,miR-122抑制劑共轉(zhuǎn)染的野生型熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)增加,但在突變型報(bào)告基因中沒(méi)有這種變化。同時(shí),miR-122的表達(dá)增加會(huì)抑制Sprouty2的野生型3′-UTR的活性,然而Sprouty2的突變型3′-UTR不受miR-122的調(diào)控。此外,miR-122抑制劑在翻譯水平促進(jìn)了Sprouty2的表達(dá)。因此,我們認(rèn)為miR-122通過(guò)直接結(jié)合Sprouty2 3′-UTR參與調(diào)控Sprouty2的表達(dá)。

我們發(fā)現(xiàn)Sprouty2在腎癌組織中的表達(dá)水平低于正常組織,表明Sprouty2在腎癌中發(fā)揮抑癌作用。同時(shí),miR-122的表達(dá)水平上調(diào)抑制Sprouty2的表達(dá),表明miR-122可能參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由此我們推測(cè),miR-122誘導(dǎo)Sprouty2表達(dá)水平降低,通過(guò)Ras/MAPK信號(hào)通路的異常激活促進(jìn)癌細(xì)胞中細(xì)胞增殖或抑制癌細(xì)胞凋亡。研究表明Sprouty2在多種癌癥中存在高甲基化[15-17],這可能導(dǎo)致其表達(dá)水平降低。但是,甲基化和miRNA都可作用于Sprouty2,導(dǎo)致其在腎癌中的表達(dá)下調(diào)。

綜上所述,miR-122可通過(guò)抑制Sprouty2的表達(dá),在腎癌中發(fā)揮致癌作用。miR-122是腎癌潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物,在未來(lái)可以針對(duì)miR-122進(jìn)行靶向治療,提高腎癌患者生存率。但是,在腎癌中是否存在其他miR-122的靶基因發(fā)揮共同作用,還需要進(jìn)一步研究。