咪鮮胺與嘧菌酯及其不同配比對(duì)禾谷鐮孢菌的毒力測(cè)定

泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系,山東 泰安271000

小麥赤霉病，是危害我國(guó)小麥生產(chǎn)的主要病害之一，由半知菌鐮孢屬禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum侵染引起，是世界性流行性病害[1]，流行年份可導(dǎo)致小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。由于近年來全球氣候逐漸變暖，以及我國(guó)耕作栽培制度調(diào)整，山東、河南和陜西等麥區(qū)小麥赤霉病的發(fā)生和流行頻率和發(fā)生程度呈現(xiàn)逐年加快、加重的趨勢(shì)[2]。2008～2012 年，山東省魯西南、魯西北地區(qū)赤霉病發(fā)生嚴(yán)重[3-5]。據(jù)山東省植?？傉窘y(tǒng)計(jì)，2001～2018 年17 年間，山東省有12 年小麥赤霉病的發(fā)生面積超過了30.65 萬hm2，有4 年的發(fā)生面積超過60 萬hm2，小麥赤霉病在山東省已由偶發(fā)病害演變?yōu)槌０l(fā)病害[6]。

在抽穗揚(yáng)花期使用苯并咪唑類殺菌劑多菌靈噴霧，是20 世紀(jì)70 年代以來防治小麥赤霉病的關(guān)鍵措施之一。但是，自1990 年以來，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)在浙江、江蘇、上海等地進(jìn)行了連年抗藥性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗性的病原菌分布范圍不斷擴(kuò)大，抗藥菌群體比例呈現(xiàn)迅速上升，華東地區(qū)已面臨多菌靈等現(xiàn)有殺菌劑防治赤霉病失敗的風(fēng)險(xiǎn)[7,8]。

咪鮮胺是一種高效、廣譜、低毒和內(nèi)吸性強(qiáng)的麥角甾醇脫甲基化抑制劑，其作用方式主要是抑制14-a-脫甲基酶的活性，使麥角甾醇的合成受阻，導(dǎo)致真菌菌體細(xì)胞膜功能異常，從而使細(xì)胞死亡，達(dá)到殺菌目的。咪鮮胺被廣泛用于治療和鏟除由尾孢屬Cercospora、核腔菌屬Pyrenophora、喙孢屬Rhynchosporium、核盤菌屬Sclerotinia、鐮孢屬Fusarium及白粉菌Erysiphe、炭疽菌Colletotrichum等致病菌引起的谷類、觀賞植物、蔬菜等作物病害[9-11]。隨著藥劑的廣泛使用及用藥量的逐年提高，病原菌對(duì)咪鮮胺的敏感性逐漸降低，已有多種植物病原菌對(duì)咪鮮胺敏感性降低或產(chǎn)生抗藥性[12,13]。

嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸類殺菌劑，屬于單一位點(diǎn)殺菌劑，殺菌譜廣，對(duì)子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌等真菌病害防治效果較好，且具有保護(hù)及治療作用。對(duì)于對(duì)苯并咪唑類、甾醇抑制劑、苯基酰胺類和二羧酰胺類藥劑產(chǎn)生抗性的真菌，嘧菌酯表現(xiàn)出良好的防效[14]。目前國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于嘧菌酯防治小麥赤霉病的文獻(xiàn)報(bào)道，有研究者報(bào)道嘧菌酯對(duì)小麥赤霉病等14 種真菌病害表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌活性[15]，也有研究者通過大田試驗(yàn)驗(yàn)證嘧菌酯對(duì)小麥赤霉病有較好的田間防治效果[16]。

為明確咪鮮胺與嘧菌酯及其混配對(duì)禾谷鐮孢菌的作用效果、篩選最佳配比，明確不同混配比例對(duì)該病菌的聯(lián)合作用類型，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了咪鮮胺與嘧菌酯混配對(duì)禾谷鐮孢菌室內(nèi)聯(lián)合毒力，從而為生產(chǎn)中藥劑復(fù)配研制與應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間

本試驗(yàn)于2015 年6 月到10 月在泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)工程系植物病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

97.0%咪鮮胺原藥、96.0%嘧菌酯原藥由青島凱源祥化工有限公司提供。

供試菌株采自山東泰安，用PDA 培養(yǎng)基經(jīng)常規(guī)組織分離法分離獲得禾谷鐮孢菌F.graminearum；經(jīng)純化、鑒定及按照柯郝氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定[17]。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，嘧菌酯單劑設(shè)置7 個(gè)系列質(zhì)量濃度，分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg·L-1；咪鮮胺單劑和5 個(gè)混配組合均設(shè)置7個(gè)系列質(zhì)量濃度，分別為0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg·L-1。在單劑毒力測(cè)定的基礎(chǔ)上，按咪鮮胺：嘧菌酯為6:2、5:2、4:2、3:2、2:2 等不同配比測(cè)定混劑的抑菌率。以藥劑有效成分在培養(yǎng)基中的濃度為測(cè)試濃度[18]。

原藥用二甲基甲酰胺溶解后，加0.1%吐溫80 水溶液稀釋成高濃度母液，采用逐級(jí)稀釋法將每種試驗(yàn)藥劑釋釋為7 個(gè)質(zhì)量濃度的藥液?？瞻讓?duì)照中注入1 mL 0.1%吐溫80 無菌水。

1.3.2 菌絲生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定 在無菌操作條件下，按照從低濃度到高濃度的次序，依次向每瓶含29 mL 定量滅菌PDA 培養(yǎng)基（溫度50～55 ℃）中，移入1.0 mL 相對(duì)應(yīng)的高濃度待測(cè)母液（母液濃度為測(cè)試濃度的30 倍），充分搖勻后分裝到直徑為9 cm 培養(yǎng)皿，制成3 個(gè)含藥平板，即每個(gè)質(zhì)量濃度3 個(gè)重復(fù)。另設(shè)不加藥劑處理的空白平板培養(yǎng)基做對(duì)照；每個(gè)處理3 次重復(fù)。

在無菌條件下用內(nèi)徑為6 mm 的打孔器從菌落邊緣切取經(jīng)純化培養(yǎng)的禾谷鐮孢菌F.graminearum菌餅，移置于帶藥培養(yǎng)基中央（菌絲面朝下與培養(yǎng)基接觸）[19]；每只培養(yǎng)皿內(nèi)放置1 個(gè)菌餅，置于，恒溫28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h 后，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取平均值，計(jì)算各藥劑每個(gè)濃度處理的菌絲生長(zhǎng)抑制率。根據(jù)如下公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)的相對(duì)抑制率：

菌絲生長(zhǎng)相對(duì)抑制率%=（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

其中分母中的對(duì)照菌落直徑為純生長(zhǎng)直徑，即為對(duì)照實(shí)際生長(zhǎng)量減去接種時(shí)的菌餅的直徑。

1.4 咪鮮胺和嘧菌酯對(duì)禾谷鐮孢菌的毒力及混劑聯(lián)合毒力評(píng)價(jià)

以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為自變量x、以菌絲生長(zhǎng)抑制率的幾率值為因變量y，計(jì)算出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)r，根據(jù)回歸方程求出各藥劑的EC50及95%置信區(qū)間。

按Wadley 法[20]，計(jì)算增效系數(shù)(SR)。根據(jù)增效系數(shù)(SR)評(píng)價(jià)藥劑混用的聯(lián)合作用類型，即SR＜0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5 為相加作用，SR＞1.5 為增效作用。

其中，A、B分別為咪鮮胺、嘧菌酯單劑，a、b為相應(yīng)單劑在混劑中的比例，EC50(th)為混劑EC50理論值，EC50(ob)為混劑EC50實(shí)測(cè)值，EC(A)50、EC(B)50分別為咪鮮胺、嘧菌酯單劑EC50值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Micosoft Excel 軟件處理，用SPSS 軟件對(duì)不同濃度的藥劑抑菌率差異顯著性做方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單劑及其混劑對(duì)禾谷鐮孢的抑制率

2 種單劑對(duì)禾谷鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率如表1 所示。

表1 咪鮮胺與嘧菌酯對(duì)禾谷鐮孢菌抑制率Table1 Inhibition rate of Prochloraz and Azoxystrobin on Fusarium graminearum

由表1 可以以看出，咪鮮胺在0.005～5.0 mg·L-1和嘧菌酯在0.001～1.0 mg·L-1濃度處理下，二者對(duì)禾谷鐮孢菌均在P＜0.05 水平上差異顯著，濃度越大，抑菌率最高。比較兩種單劑在相同濃度下的抑菌率見圖1。

由圖1 可以看出，在0.0051 mg·L-1、0.01 mg·L-1濃度處理下，嘧菌酯對(duì)禾谷鐮孢菌的抑菌效果顯著大于咪鮮胺；0.05 mg·L-1、0.1 mg·L-1濃度處理下，二者抑菌效果差異不顯著；0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1濃度處理下，咪鮮胺對(duì)禾谷鐮孢菌的抑菌效果顯著大于嘧菌酯。

圖1 咪鮮胺與嘧菌酯對(duì)禾谷鐮孢菌抑制率Fig.1 Inhibition rate of Prochloraz and Azoxystrobin onFusarium graminearum

2 種單劑不同比例混配對(duì)禾谷鐮孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率如表2 所示。

表2 咪鮮胺與嘧菌酯不同混配對(duì)禾谷鐮孢菌的抑制率Table 2 Inhibition rate of different mixed combinations of Prochloraz and Azoxystrobin on Fusarium graminearum

由表2 可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，無論哪種混配比例，不同濃度對(duì)禾谷鐮孢菌的抑菌率在P＜0.05 水平上均差異顯著，有隨著濃度增大，抑菌率提高的趨勢(shì)。在相同濃度處理下，不同配比組合抑菌率在P＜0.05 水平上差異顯著。

2.2 單劑與混劑之間抑菌率的差異顯著性

咪鮮胺和嘧菌酯單劑抑菌率與混劑不同濃度下的最大和最小抑菌率見表3。

表3 咪鮮胺和嘧菌酯單劑抑菌率與混劑不同濃度下抑菌率比較Table 3 Comparison of the inhibitory rate of Prochloraz and Azoxystrobin and the inhibitory rate of the two mixture at different concentrations

由表3 可以看出，在1 mg·L-1、5 mg·L-1濃度處理下，咪鮮胺單劑與混劑最大抑菌率和最小抑菌率均表現(xiàn)為差異不顯著；其0.5 mg·L-1濃度處理下，咪鮮胺單劑與混劑最大和最小抑菌率差異不顯著；

在0.1 mg·L-1～0.005 mg·L-1濃度處理下，咪鮮胺單劑與混劑最大和最小抑菌率均表現(xiàn)為差異顯著，且混劑最大抑菌率顯著大于咪鮮胺單劑。

在0.005 mg·L-1、0.01 mg·L-1濃度處理下，嘧菌酯單劑與混劑最大抑菌率和最小抑菌率均表現(xiàn)為差異顯著，且抑菌效果優(yōu)于相同濃度處理下的混劑；其他濃度處理下，嘧菌酯單劑與混劑最大抑菌率和最小抑菌率均表現(xiàn)為差異顯著，并且混劑的抑菌率要顯著高于嘧菌酯單劑的抑菌率。

2.3 咪鮮胺和嘧菌酯對(duì)禾谷鐮孢菌的毒力及混劑聯(lián)合毒力評(píng)價(jià)

2 種單劑和5 種混配組合對(duì)禾谷鐮孢菌的作用模型見表3。咪鮮胺、嘧菌酯單劑對(duì)小麥赤霉病菌的EC50分別為0.058 mg·L-1、0.030 mg·L-1。咪鮮胺:嘧菌酯為6:2、5:2、4:2、3:2、2:2 等5 個(gè)供試配比的EC50分別為0.027mg·L-1、0.025 mg·L-1、0.023 mg·L-1、0.028 mg·L-1、0.032 mg·L-1。

表3 咪鮮胺、嘧菌酯及5 種配比對(duì)禾谷鐮孢菌力回歸分析Table 1 Regression analysis of the toxicity of prochloraz,azoxystrobin,and five combinations to wheat scab

從表3 數(shù)據(jù)可見，在咪鮮胺與嘧菌酯的5 個(gè)供試配比中，6:2、5:2、4:2、3:2 配比的SR 均大于1.5，分別為1.76、1.84、1.90、1.54，這表明兩種藥劑復(fù)配對(duì)禾谷鐮孢菌的聯(lián)合作用類型表現(xiàn)為增效作用，其中，4:2 配比的SR 最大、增效作用最明顯。2:2 配比的SR 值為1.25，表明二者復(fù)配對(duì)禾谷鐮孢菌聯(lián)合作用類型為相加作用。

3 結(jié)論與討論

目前對(duì)小麥赤霉病尚缺少有效的抗病品種，因此，選擇適當(dāng)藥劑并采用科學(xué)合適的施藥方法是防治小麥赤霉病的重要措施[21]。研究表明，咪鮮胺與嘧菌酯對(duì)禾谷鐮孢菌的EC50分別是0.058 mg·L-1、0.030 mg·L-1，而多菌靈和己唑醇對(duì)禾谷鐮孢菌的EC50值分別為0.405 mg·L-1、0.642 mg·L-1[22]，說明咪鮮胺與嘧菌酯對(duì)禾谷鐮孢菌的作用效果與多菌靈、己唑醇等常用藥劑比較，活性較高。

試驗(yàn)中的5 種混配組合對(duì)禾谷鐮孢菌的聯(lián)合作用類型均表現(xiàn)為增效或相加作用。上述兩種藥劑按6:2、5:2、4:2 和3:2 的比例混配，增效系數(shù)分別為1.76、1.84、1.90、1.54，均大于1.5，表現(xiàn)為增效作用，其中，4:2 比例增效作用最佳；說明，二者混配有望用于治理對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗性的禾谷鐮刀菌所引起的小麥赤霉病，并可延緩禾谷鐮孢菌對(duì)咪鮮胺及嘧菌酯的抗藥性。本研究結(jié)果為生產(chǎn)中農(nóng)藥的混用或復(fù)配使用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，咪鮮胺、嘧菌酯單劑對(duì)小麥赤霉病菌均有較高室內(nèi)生物活性；在供試配比中，二者按4:2 的比例混配對(duì)小麥赤霉病菌增效作用最明顯。制劑配比的確定，還要考慮加工工藝、制劑理化穩(wěn)定性、成本、用藥習(xí)慣等其他因素。

由于藥劑對(duì)病害的作用效果在自然條件下要受品種、氣候等其他因素的影響，室內(nèi)生測(cè)結(jié)果與田間藥效結(jié)果有待于研究。