新型小動(dòng)物口鼻暴露系統(tǒng)對(duì)葉菌唑原藥急性吸入毒性試驗(yàn)

吳宗澄，張述陽，張智博，張曉軍，金 迪，王華琳

(沈陽沈化院測(cè)試技術(shù)有限公司安全評(píng)價(jià)中心/國(guó)家沈陽新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，沈陽 110141)

1 引言

葉菌唑原藥是一種新型三唑類廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，主要用于防治小麥赤霉病、小麥白粉病以及小麥銹病等禾谷類作物病害[1]。對(duì)殼針孢屬和銹病活性優(yōu)異，兼具優(yōu)良的保護(hù)及治療作用，既可莖葉處理又可作種子處理[1, 2]。葉菌唑是生產(chǎn)上控制小麥病害的重要?dú)⒕鷦┢贩N[1, 3]。該殺菌劑殺菌活性高、抗菌譜廣、內(nèi)吸性強(qiáng), 在農(nóng)藥領(lǐng)域中舉足輕重[1, 4]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)于葉菌唑毒性測(cè)定LD50值(mg/kg)的報(bào)道，其中雄性大鼠急性經(jīng)口劑量為2000 mg/kg、雌性大鼠>2000 mg/kg，雄性大鼠的急性經(jīng)皮試驗(yàn)濃度>2000 mg/kg、雌性>2000 mg/kg，葉菌唑?qū)彝闷つw無刺激性，對(duì)家兔眼睛為輕度刺激性[1, 5, 6]。關(guān)于葉菌唑氣相色譜-質(zhì)譜法( GC-MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法( GC-MS /MS) 以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法( HPLC-MS /MS) 檢測(cè)方法均有報(bào)道等[6, 7]。但有關(guān)葉菌唑原藥大鼠吸入毒性的報(bào)道很少，既原有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)是使用舊型暴露系統(tǒng)測(cè)試得到的吸入毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，但舊型暴露設(shè)備及吸入毒性試驗(yàn)方法陳舊，科學(xué)性誤差較大，暴露效果缺乏，數(shù)據(jù)可靠性低。本實(shí)驗(yàn)參照OECD化學(xué)品測(cè)試為準(zhǔn)則[8]，利用新型口鼻暴露系統(tǒng)對(duì)SD大鼠的急性吸入毒性試驗(yàn)來測(cè)定葉菌唑原藥的急性吸入毒性，了解其經(jīng)呼吸道進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后對(duì)呼吸道以及全身的損傷和危害程度，為該農(nóng)藥的毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)提供較為可靠性的科學(xué)資料，為其亞急性吸入毒性試驗(yàn)及亞慢性吸入毒性試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 受試物與儀器

葉菌唑原藥為白色固體粉末，純度為95%，由某農(nóng)藥公司提供。稱取60.0 g受試樣品，先用研砵進(jìn)行研磨，把樣品中的顆粒物研碎，再用九陽磨粉機(jī)進(jìn)行粉碎，最后用行星式球磨儀研磨，處理完畢之后在用銅網(wǎng)進(jìn)行篩選，篩選完畢的樣品存于樣品室待用。所用主要儀器為：新型小動(dòng)物口鼻單濃度動(dòng)態(tài)暴露系統(tǒng)選購(gòu)于北京慧榮和科技有限公司，304不銹鋼300目篩網(wǎng)購(gòu)自安徽億匯篩網(wǎng)有限公司，行星式高能球磨儀選購(gòu)于德國(guó)萊馳公司，安德森串級(jí)撞擊器粒徑分析系統(tǒng)購(gòu)于北京賽克瑪環(huán)保儀器有限公司。

2.2 動(dòng)物來源與飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供(許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002)。引入動(dòng)物后適應(yīng)時(shí)間為5d，每籠2只動(dòng)物，并在引入當(dāng)天進(jìn)行適應(yīng)期觀察，健康檢查與體重稱量。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所食飼料為滅菌全價(jià)型營(yíng)養(yǎng)粉料，可自由飲水，動(dòng)物房溫度為20～25 ℃，濕度為40%～70%，光周期自動(dòng)控制，每天明暗各12 h。同時(shí)進(jìn)行適應(yīng)性保護(hù)和固定，以確保在正式試驗(yàn)時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能夠適應(yīng)固定器所帶來的物理壓力，溫度壓力及行動(dòng)障礙。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 劑量設(shè)計(jì)

參照OECD化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則，設(shè)計(jì)5000 mg/m3、2000 mg/m、31000 mg/m3、0 mg/m3，根據(jù)體重采用隨機(jī)分組法分為4組，對(duì)照組和高劑量組每組20只，雌雄各半，低劑量和中劑量組每組10只，雌雄各半。分組時(shí)組內(nèi)動(dòng)物體重不能超過平均動(dòng)物體重的±20%，若5000 mg/m3劑量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組均未出現(xiàn)死亡，則急性吸入毒性試驗(yàn)LC50的判定結(jié)果大于5000 mg/m3。

2.3.2 暴露途徑及方法

采用動(dòng)式吸入暴露方法，使用新型小動(dòng)物口鼻單濃度動(dòng)態(tài)暴露系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行吸入暴露。多節(jié)口鼻暴露單元沿著內(nèi)筒的軸線順次連接組成口鼻暴露組，在口鼻暴露塔的頂端連接粉末氣溶膠發(fā)生器，底端連接廢氣回收處理裝置。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的4個(gè)劑量同時(shí)運(yùn)行4臺(tái)小動(dòng)物單濃度口鼻暴露系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試試驗(yàn)，空白組試驗(yàn)參數(shù)方案與高劑量組一致。試驗(yàn)開始前，將動(dòng)物分別放入固定器中，動(dòng)物給藥前先對(duì)口鼻暴露組內(nèi)濃度進(jìn)行調(diào)試，通過調(diào)整發(fā)生器進(jìn)給速度，進(jìn)氣流量及稀釋流量來調(diào)試暴露腔內(nèi)氣溶膠濃度，如果連續(xù)2次檢測(cè)濃度波動(dòng)范圍小于±20%，則可以進(jìn)行正式試驗(yàn)，將裝有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的固定器安裝在口鼻暴露塔上，暴露時(shí)間為4h，暴露期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食禁水。染毒結(jié)束動(dòng)物放回籠內(nèi)并觀察，自由飲水和攝食。

2.3.3 供試品暴露參數(shù)檢測(cè)

染毒過程中對(duì)樣品實(shí)際濃度和粒徑分布進(jìn)行測(cè)定、監(jiān)測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)氣溶膠流量、進(jìn)樣速度、稀釋流量，抽氣流量，暴露腔內(nèi)溫度、壓力、相對(duì)濕度、氧氣濃度和二氧化碳濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。暴露系統(tǒng)對(duì)環(huán)境參數(shù)采用每秒自動(dòng)監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)自動(dòng)記錄于設(shè)備中，試驗(yàn)結(jié)束自動(dòng)生成試驗(yàn)報(bào)表，數(shù)據(jù)顯示整個(gè)暴露期間參數(shù)均值。

濃度測(cè)量：采樣前稱量濾膜重量為M1，采樣結(jié)束后稱量濾膜和樣品重量為M2，計(jì)算采樣重量(M)，M=M2-M1，暴露腔內(nèi)氣溶膠濃度為C(mg/m3)=采樣質(zhì)量(M)/采樣體積(V)×1000(L/m3)。

粒徑測(cè)定：使用安德森串級(jí)撞擊器粒徑分析系統(tǒng)對(duì)暴露腔內(nèi)粒子空氣動(dòng)力學(xué)直徑進(jìn)行測(cè)定。主要測(cè)定2個(gè)指標(biāo)： ①粒子空氣動(dòng)力學(xué)直徑質(zhì)量中值(MMAD)，②粒子空氣動(dòng)力學(xué)幾何標(biāo)準(zhǔn)差(GSD)。

2.3.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察與體重稱量

暴露結(jié)束時(shí)應(yīng)對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行觀察，在試驗(yàn)結(jié)束約1 h后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物再進(jìn)行一次癥狀觀察，從試驗(yàn)開始到結(jié)束，應(yīng)每天進(jìn)行癥狀觀察并記錄各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒癥狀及其發(fā)生和緩解、消失的時(shí)間。應(yīng)詳細(xì)記錄被毛、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)消化系統(tǒng)，眼睛和粘膜所產(chǎn)生的癥狀變化，特別注意觀察供試品對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響，如供試品對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的呼吸道產(chǎn)生刺激反應(yīng)，呼吸頻率的變化以及呼吸和呼吸模式的改變。

體重稱量：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物引入24 h之內(nèi)，暴露前1 d，暴露日暴露前(第0)，暴露后第1 d、第3 d、第7 d和第14 d進(jìn)行體重測(cè)定。

2.3.5 大體解剖檢查

試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)全部存活動(dòng)物 CO2麻醉，并對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行放血與解剖檢查。動(dòng)物進(jìn)行大體解剖時(shí)應(yīng)全面仔細(xì)觀察肺部及上呼吸道的刺激以及局部毒性刺激產(chǎn)生的癥狀，同時(shí)檢查胸腔、腹腔、顱腔、各個(gè)天然孔道及其內(nèi)容物，并詳細(xì)記錄每只動(dòng)物的解剖后的癥狀變化。

2.3.6 組織病理學(xué)檢查

試驗(yàn)期間死亡的動(dòng)物以及試驗(yàn)結(jié)束后的剩余動(dòng)物都應(yīng)進(jìn)行解剖和組織病理學(xué)檢查。

2.3.7 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果評(píng)價(jià)

分別統(tǒng)計(jì)不同劑量組的動(dòng)物數(shù)目、出現(xiàn)的癥狀、存活數(shù)與死亡數(shù)，及時(shí)觀察大體解剖與病理學(xué)組織學(xué)檢查時(shí)各個(gè)器官所發(fā)生病變的頻率并計(jì)算各劑量組中雌雄動(dòng)物產(chǎn)生該上述項(xiàng)目的發(fā)生頻率，統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重均值與標(biāo)準(zhǔn)差。

根據(jù)供試品濃度和動(dòng)物死亡率，使用SPSS19.0軟件計(jì)算急性吸入的LC50的值。根據(jù)LC50的結(jié)果與表1和表2進(jìn)行毒性分級(jí)。

表1 GHS急性吸入毒性分類標(biāo)準(zhǔn)

表2 毒性分級(jí)

3 結(jié)果分析

3.1 暴露期間環(huán)境參數(shù)均值

在暴露過程中對(duì)暴露腔內(nèi)氣溶膠流量、稀釋流量，暴露腔內(nèi)溫度、相對(duì)濕度、氧氣濃度和二氧化碳濃度等導(dǎo)則要求的環(huán)境參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，暴露系統(tǒng)對(duì)環(huán)境參數(shù)采用每秒自動(dòng)監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)自動(dòng)記錄于設(shè)備中，試驗(yàn)結(jié)束自動(dòng)生成試驗(yàn)報(bào)表，數(shù)據(jù)顯示整個(gè)暴露期間參數(shù)均值，結(jié)果見表3.

3.2 實(shí)際濃度和粒徑分布

暴露期間暴露腔內(nèi)的氣溶膠實(shí)際濃度被測(cè)量，從高到低實(shí)際濃度分別為5038±33、2065±50、1005±25 mg/m3。實(shí)測(cè)濃度結(jié)果見表4。

使用粒子空氣動(dòng)力學(xué)粒徑譜分布儀管理軟件進(jìn)行采集和測(cè)定，主要測(cè)定兩個(gè)指標(biāo):①粒子空氣動(dòng)力學(xué)直徑質(zhì)量中值(MMAD)，②粒子空氣動(dòng)力學(xué)幾何標(biāo)準(zhǔn)(GSD)，結(jié)果見表5。

表3 環(huán)境參數(shù)結(jié)果

表4 實(shí)際濃度結(jié)果

表5 粒徑分布

3.3 死亡結(jié)果及觀察

5000 mg/m3劑量組雌雄動(dòng)物吸入暴露結(jié)束后第1 d，雌雄各2只動(dòng)物出現(xiàn)自發(fā)運(yùn)動(dòng)低下癥狀，暴露第2 d，雌性2只動(dòng)物死亡，3只穿自發(fā)運(yùn)用低下，呼吸聲音異常，步行困難等癥狀，雄性3只死亡，2只出現(xiàn)自發(fā)運(yùn)動(dòng)低下，口鼻周有分泌物癥狀；第3 d雌雄動(dòng)物全部死亡。

2000 mg/m3劑量組吸入暴露第1 d后，雌性1只動(dòng)物出現(xiàn)自發(fā)運(yùn)動(dòng)低下，雄性1只動(dòng)物死亡；吸入暴露2 d后，3只出現(xiàn)被毛蓬松，會(huì)陰污穢，1只出現(xiàn)被毛蓬松，口鼻周有分泌物；2只自發(fā)運(yùn)動(dòng)低下；吸入暴露第3 d后，雌性2只死亡，雄性癥狀逐漸恢復(fù)；吸入暴露第4 d后，所有動(dòng)物癥狀減輕；吸入暴露第5 d后，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均正常。

1000 mg/m3劑量組和空白對(duì)照組給藥后沒有死亡，連續(xù)觀察14 d至試驗(yàn)結(jié)束沒有異常改變。

3.4 體重稱量結(jié)果

高、中和低濃度組動(dòng)物體重在暴露后第1 d雌雄都呈現(xiàn)體重降低趨勢(shì)，在第3 d都基本恢復(fù)正常，一直到試驗(yàn)結(jié)束都呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，結(jié)果見表6。

表6 體重稱量結(jié)果

3.5 解剖與組織學(xué)觀察結(jié)果

高和中劑量組動(dòng)物的死亡解剖均發(fā)現(xiàn)肝臟暗紅色癥狀，有肺部紅斑癥狀；其他計(jì)劃解剖未見異常；組織學(xué)所見：葉菌唑原藥對(duì)高劑量組和中劑量組死亡動(dòng)物的肝臟有輕度的致肝細(xì)胞肥大的作用和對(duì)肺臟有致泡沫細(xì)胞團(tuán)的作用。

4 結(jié)論與討論

根據(jù)葉菌唑暴露濃度和動(dòng)物死亡率，使用SPSS19.0軟件用概率單位法方法計(jì)算急性吸入的LC50的值，雄鼠為2221 mg/m3，雌鼠為2064 mg/m3。根據(jù)之前報(bào)道過的葉菌唑大鼠急性經(jīng)口毒性LD50為雄性1470 mg/kg，雌性1080 mg/kg ，大鼠急性經(jīng)皮毒性LD50為>2000 mg/kg，同時(shí)根據(jù)GHS標(biāo)準(zhǔn)(表1)對(duì)烯肟菌酯進(jìn)行急性毒性分級(jí)，烯肟菌酯原藥急性吸入毒性為4級(jí)，屬于低毒。同時(shí)結(jié)果表明：葉菌唑?qū)Π衅鞴贋楦闻K和肺臟。

小麥作為重要的糧食作物，在中國(guó)人餐桌上的呈現(xiàn)形式多種多樣。因此，優(yōu)質(zhì)小麥種植的意義深遠(yuǎn)，小麥的安全生產(chǎn)備受關(guān)注。實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)小麥的無公害生產(chǎn)，提高國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力，增加農(nóng)民收入，是我國(guó)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。葉菌唑原藥是一種活性高、抗菌譜廣、內(nèi)吸性強(qiáng)的殺菌劑，主要用于防治小麥赤霉病、小麥白粉病以及小麥銹病等禾谷類作物病害[1]。對(duì)殼針孢屬和銹病活性優(yōu)異，兼具優(yōu)良的保護(hù)及治療作用，既可莖葉處理又可作種子處理。葉菌唑是生產(chǎn)上控制小麥病害的重要?dú)⒕鷦┢贩N。但有關(guān)葉菌唑原藥吸入毒性的報(bào)道尚未見到。本試驗(yàn)使用新型小動(dòng)物口鼻暴露系統(tǒng)來檢測(cè)葉菌唑原藥對(duì)SD大鼠的急性吸入性，了解了其吸入動(dòng)物呼吸道后對(duì)呼吸道與全身的損傷以及危害。對(duì)未來葉菌唑的安全使用可提供有效的試驗(yàn)依據(jù)。