柳葉蠟梅揮發(fā)油提取及β-環(huán)糊精包合工藝的優(yōu)化

張娜娜，劉忠達(dá)，徐文崢，朱建麗，袁宙新

(麗水市中醫(yī)院·浙江 麗水 323000)

柳葉蠟梅(Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu)為蠟梅屬植物，又名食涼茶、黃金茶等，比較適宜在深山區(qū)生長(zhǎng)，主要分布在我國(guó)浙江、江西、湖南、江蘇等地[1]，在畬族民間應(yīng)用比較普遍。有研究表明柳葉蠟梅具有抑菌抗炎、清熱解毒、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳祛痰等功效[2-3]，其主要成分為揮發(fā)油[4-5]，但揮發(fā)油在使用過程中存在對(duì)空氣和溫度敏感、容易氧化、存儲(chǔ)和制劑過程中容易揮散等缺點(diǎn)。為提高柳葉蠟梅揮發(fā)油制劑的穩(wěn)定性，本文通過水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，然后用β-環(huán)糊精對(duì)提取出的揮發(fā)油進(jìn)行包合，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化揮發(fā)油提取及β-環(huán)糊精包合工藝，用指紋圖譜法驗(yàn)證包合物的形成，以期為提高柳葉蠟梅揮發(fā)油穩(wěn)定性、促進(jìn)柳葉蠟梅的利用提供技術(shù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BS 124S電子天平：Sartorius；6890N型氣相色譜儀，配有FID檢測(cè)器：Agilent；JB-50D型電動(dòng)攪拌器：上海標(biāo)本模型廠。

1.2 試藥 柳葉蠟梅(產(chǎn)地蓮都)：購(gòu)自杭州桐君堂醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)本院中藥房鑒定為臘梅科屬植物柳葉臘梅的葉。β-環(huán)糊精：購(gòu)自廣東郁南縣環(huán)糊精廠，純度大于98%；環(huán)己酮、正己烷、乙腈均為色譜純，水為重蒸餾水(自制)，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取工藝

2.1.1 揮發(fā)油含量測(cè)定 分別取柳葉蠟梅葉400 g，各加6 倍量水。采用直接蒸餾法提取，讀取不同提取時(shí)間所得揮發(fā)油毫升數(shù)。結(jié)果顯示提取4 h，揮發(fā)油含量最高。見表1。

表1 不同提取時(shí)間揮發(fā)油得量

2.1.2 提取工藝優(yōu)化 根據(jù)上述試驗(yàn)，結(jié)合查閱文獻(xiàn)，選取藥材粒度(A)、提取時(shí)間(B)、溶媒用量(C)作為考察因素，選擇揮發(fā)油量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平及試驗(yàn)結(jié)果見表2～表4。

表2 揮發(fā)油提取工藝因素水平

表3 揮發(fā)油提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 提取工藝方差分析

表4的方差分析結(jié)果顯示，因素A和B對(duì)柳葉蠟梅揮發(fā)油的提取影響具顯著性，因素C無(wú)顯著性影響。表4直觀分析結(jié)果表明， 柳葉蠟梅揮發(fā)油最佳提取工藝應(yīng)為A3B2C1，即藥材粗粉，加6倍水，提取4 h。但考慮到粗粉蒸餾過程易增泡沫，并伴隨水蒸汽進(jìn)入揮發(fā)油中，故選工藝A2B2C1，即藥材碎葉片，加6倍量水，提取4 h。

2.1.3 揮發(fā)油提取工藝驗(yàn)證 稱取柳葉蠟梅(碎葉片)3份，按照2.1.2項(xiàng)下優(yōu)選工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得揮發(fā)油收率分別為2.0%(mL/g)、2.3%(mL/g)、2.2%(mL/g)，試驗(yàn)結(jié)果顯示該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2 β-環(huán)糊精包合工藝

2.2.1 包合試驗(yàn)方法 精密稱取適量β-環(huán)糊精加入于三口燒瓶中，加入適量蒸餾水，加熱溶解，緩緩冷卻至60 ℃，制成飽和溶液，恒定溫度。在400 r/min下滴加揮發(fā)油醇液，攪拌2 h，置冰箱冷藏24 h，濾過，以少量乙醇洗滌4 次，低溫干燥，粉碎，過80目篩，即得疏松狀白色包合物粉末。

2.2.2 包合物實(shí)際含油量測(cè)定 精密稱取β-環(huán)糊精包合物干燥粉末適量，加水，按照揮發(fā)油含量測(cè)定法(中國(guó)藥典2015年版四部2204 揮發(fā)油測(cè)定法)[7]，測(cè)定β-環(huán)糊精包合物實(shí)際含油量。

2.2.3 包合工藝優(yōu)化 預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，影響包合的主要因素為β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的比例(A)，反應(yīng)溫度(B)、攪拌時(shí)間(C)。選取此三個(gè)影響因素為考察因素，選擇包合物含油率[包合物中實(shí)際含油量/包合物實(shí)際重量×100%]、包合物油利用率[包合物中實(shí)際含油量/(投油量×空白回收率)×100%]為考察指標(biāo)，按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平及試驗(yàn)結(jié)果見表5～表8。

表5 包合工藝因素水平

表6 包合工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 以包合物含油率為指標(biāo)進(jìn)行方差分析

表8 以油利用率為指標(biāo)進(jìn)行方差分析

表7和表8的方差分析結(jié)果顯示，因素A和B對(duì)揮發(fā)油包合率的影響比較顯著，因素C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小。從方差分析結(jié)果來看，以包合物含油率為指標(biāo)，最佳工藝為：A2B2C2；以油利用率為指標(biāo)，最佳工藝為：A3B2C3。但在在實(shí)際生產(chǎn)中為縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，一般選擇包合工藝A2B2C2，即β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的比例為8∶1(g∶mL)，包合溫度60 ℃，攪拌時(shí)間2 h。

2.2.4 包合工藝驗(yàn)證 按照2.2.3項(xiàng)下優(yōu)選的最佳工藝制備3批柳葉蠟梅β-環(huán)糊精包合物，3批試驗(yàn)得到包合物干粉分別為14.08、14.12、14.04 g，平均得粉為14.08 g；餾出油量分別為1.45、1.50、1.42 mL，平均得油量1.46 mL，計(jì)算平均含油率為10.36%，包合率為73.0%。

2.3 包合物指紋圖譜表征

2.3.1 供試品溶液的制備 稱取柳葉蠟梅β-環(huán)糊精包合物20 g，按照藥典附錄XD-1揮發(fā)油測(cè)定；通過水蒸氣蒸餾法收集揮發(fā)油，脫水，取揮發(fā)油18 mg，精密稱定，用正己烷溶解定容至10 mL，搖勻，作為供試品溶液。

2.3.2 對(duì)照品的制備 精密稱取柳葉蠟梅揮發(fā)油18 mg，置10 mL 容量瓶中，用正己烷定容至刻度，作為對(duì)照品溶液。

2.3.3 測(cè)定方法及結(jié)果 色譜柱INNOWAX(0.32 mm×30 m×0.5 μm)彈性石英毛細(xì)管柱；柱溫70 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升溫至95 ℃，12 ℃/min升溫至157 ℃，2 ℃/min升溫至225 ℃，保持7 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度為280 ℃，分流比為1:40；理論板數(shù)按桉油素峰計(jì)算不應(yīng)低于10 000。分別精密量取供試品溶液、對(duì)照品溶液各0.2 μL，注入氣相色譜儀，記錄各個(gè)峰的保留時(shí)間和積分面積，結(jié)果見圖1～圖2。

圖1 柳葉蠟梅揮發(fā)油指紋圖譜

圖2 柳葉蠟梅β-環(huán)糊精包合物指紋圖譜

2.3.4 測(cè)定結(jié)果分析 從相對(duì)保留時(shí)間來看，柳葉蠟梅β-環(huán)糊精包合物色譜峰的6個(gè)共有峰包含在柳葉蠟梅揮發(fā)油的7個(gè)峰中，1(0.5129)，2(0.6933)，3(0.8190)，4(0.9489)，5(s)(1.0000)，6(2.1532)。

從相對(duì)峰面積比值來看，柳葉蠟梅β-環(huán)糊精包合物的1號(hào)峰(0.5129)，其平均峰面積比值(0.0794)在柳葉蠟梅1號(hào)峰(0.5128)峰面積比值(0.0774～0.1438)之間。因柳葉蠟梅β-環(huán)糊精包合物是以柳葉蠟梅和β-CD包合而成，其1號(hào)峰峰面積比值應(yīng)反映柳葉蠟梅的1號(hào)峰峰面積比值。結(jié)果表明柳葉蠟梅指紋圖譜與其β-環(huán)糊精包合物指紋圖譜非常相近，符合原料油與制劑之間指紋譜相近性的要求。

從共有峰的個(gè)數(shù)來看，柳葉蠟梅β-環(huán)糊精包合物有6個(gè)共有峰，柳葉蠟梅有7個(gè)共有峰。出現(xiàn)這種情況，可能由于制劑中的揮發(fā)油經(jīng)包合、樣品蒸餾提取兩個(gè)過程的處理，導(dǎo)致包合物樣品的指紋圖譜中的第7個(gè)峰的不穩(wěn)定性，也可能第7個(gè)峰的物質(zhì)與β-CD結(jié)合非常牢固，不容易被水蒸氣蒸餾出來之故。因此柳葉蠟梅β-環(huán)糊精包合物只有6個(gè)共有峰。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)整葉片、碎葉片、粗粉 3種不同粒度的柳葉蠟梅進(jìn)行揮發(fā)油提取，發(fā)現(xiàn)研磨成粗粉，揮發(fā)油提取量較大，但是粗粉在蒸餾過程易增泡沫，并伴隨水蒸汽進(jìn)入揮發(fā)油中；對(duì)揮發(fā)油提取時(shí)間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)4 h提取量>5 h提取量>3 h提取量，可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過短，揮發(fā)油還未提取完全；若提取時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)油的揮發(fā)和氧化損失，因此本試驗(yàn)確定最佳提取工藝為柳葉蠟梅碎葉片、加入6倍量水，提取4 h。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在揮發(fā)油提取器中加入一定量正己烷來收集揮發(fā)油，等正己烷徹底揮干后再進(jìn)行精密稱定，可以解決揮發(fā)油微量揮發(fā)導(dǎo)致讀數(shù)不準(zhǔn)的缺陷。

在包合物制備過程中發(fā)現(xiàn)，以包合物含油率、油利用率進(jìn)行分別分析，均顯示60 ℃的包合物收率高于40 ℃、80 ℃的收率，表明隨著包合溫度的升高、包合反應(yīng)速度的加快，生成的包合物量也越大；但溫度過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致部分揮發(fā)油揮發(fā)，減少包合物生成量；溫度過低時(shí)，導(dǎo)致β-環(huán)糊精溶解度下降，亦會(huì)減少包合物生成量。對(duì)β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的比例、攪拌時(shí)間考察發(fā)現(xiàn)，包合物的生成量與β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的比例、攪拌時(shí)間呈正相關(guān)；但為縮短周期、節(jié)約成本，本試驗(yàn)選擇β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的比例8∶1(g∶mL)，包合溫度60 ℃，攪拌時(shí)間為2 h為最佳工藝。

指紋圖譜表征顯示柳葉臘梅與β-環(huán)糊精包合已經(jīng)形成，包合狀態(tài)良好；同時(shí)對(duì)提取工藝、包合工藝進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該工藝操作方便、穩(wěn)定可行，對(duì)提高柳葉蠟梅中揮發(fā)油的穩(wěn)定性，促進(jìn)柳葉蠟梅的使用利用有著積極意義。