中醫(yī)手法治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床療效觀察及其對NF-κB信號通路的影響

孫松濤，鐘 聲，許 輝，解 駿，高晨鑫，翟偉韜，肖漣波

(1上海中醫(yī)藥大學·上海 201203；2上海中醫(yī)藥大學附屬光華醫(yī)院·上海 200052)

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨進行性退變?yōu)楹诵牟±頇C制的骨關(guān)節(jié)病變，嚴重影響中老年人的生活質(zhì)量。流行病學調(diào)查顯示，我國40歲及以上人群KOA總患病率為28.7%，且隨著年齡增長顯著升高，60歲以上人群的患病率高達43.94%[1]，現(xiàn)已成為一項重要的世界性衛(wèi)生問題。研究表明KOA的發(fā)病過程與軟骨代謝機制存在一定關(guān)聯(lián)，但其具體發(fā)病機制尚不明確，有研究認為機械力通過NF-κB信號通路對細胞形態(tài)、功能的調(diào)節(jié)有重要影響，抑制NF-κB信號通路的活化，有助于保護關(guān)節(jié)軟骨[2]。推拿手法治療KOA的臨床療效確切，但其對軟骨修復(fù)的作用仍存在爭議，多以離體、動物實驗或在體影像學MRI對比研究為主，目前缺少治療后直接軟骨觀察證據(jù)[3-4]。本研究采用中醫(yī)推拿手法和全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(TKA)治療KOA患者，并分析其對軟骨細胞NF-κB信號通路、iNOS表達水平的影響，旨在研究推拿手法治療對關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)效果及作用機制，為KOA的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

本研究病例均來源于上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科。納入標準：①均符合美國風濕病學會1995年制訂的《膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎診斷標準》[5]，且經(jīng)放射檢查確診。②年齡在40～65 歲，且符合TKA適應(yīng)癥。③無嚴重基礎(chǔ)疾病。④均已達成共識，并簽署知情同意書。排除標準：①膝部有外傷或手術(shù)史者；②膝部結(jié)核、腫瘤及骨髓炎等患者；③梅毒性神經(jīng)病、牛皮癬、褐黃病、代謝性骨病、急性創(chuàng)傷等患者；④有藥物過敏史者；⑤嚴重肝腎功能不全、糖尿病、嚴重心血管疾病及精神疾病者。

根據(jù)上述標準共收集20例KOA患者，先行推拿手法治療再行TKA患膝取材。其中男9例，女11例；年齡42～65歲，平均(53.8±4.9)歲；病程3～11年，平均(5.8±1.9)年；術(shù)前膝關(guān)節(jié)活動度5°～100°，平均(41.7°±5.8°)。將患者按照隨機數(shù)字表法隨機分為A組(推拿手法組)、B組(空白對照組)，每組10 例。兩組的性別構(gòu)成比、年齡、病程、關(guān)節(jié)功能等基本資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究設(shè)計符合《赫爾辛基宣言》，均獲得患者的知情同意并簽署知情同意書。

2 方法

2.1 治療方法

A組：采用推拿治療配合拔伸，每周3次，每次20 min，療程為3個月。操作手法[6]：先取仰臥位，于患側(cè)股前、內(nèi)、外側(cè)肌群行法，于患側(cè)膝關(guān)節(jié)周圍(伏兔、犢鼻、梁丘、鶴頂膝眼、血海、足三里、陰陵泉、陽陵泉、阿是穴、三陰交)行按揉法。調(diào)整體位至俯臥位，于大腿后側(cè)、腘窩及小腿后部肌群行法，于委陽、委中、合陽、承山、陰谷、陽谷行按揉法。法操作頻率120～140 次/min。膝關(guān)節(jié)拔伸牽引：雙手握持小腿遠端，拔伸并持續(xù)2 s，力量以膝關(guān)節(jié)有牽開感為度，反復(fù)5 次，然后用同樣的方法牽引30 s。

B組：通過門診健教處方發(fā)放、健康講座、電話咨詢等方式進行健康宣教，療程3個月。A組與B組在3個月的療程結(jié)束后，行TKA術(shù)取其患膝軟骨。

2.2 觀察指標

2.2.1 膝關(guān)節(jié)功能評定 患者均于治療前、治療后3個月采用美國特種外科醫(yī)院評分(HSS)[7]評定膝關(guān)節(jié)功能。HSS評分包含疼痛(30分)、功能(22分)、活動范圍(18分)、肌力(10分)、屈曲畸形(10分)、關(guān)節(jié)穩(wěn)定性(10分)6 個維度，分值范圍為0～100 分。評分越高，說明關(guān)節(jié)功能恢復(fù)越好。

2.2.2 膝關(guān)節(jié)軟骨生物力學測定 將TKA術(shù)后患膝關(guān)節(jié)軟骨，以浸泡過生理鹽水的紗布包裹并裝入密封袋中，置于-20 ℃低溫冰箱中保存待測。保存10～15 d，實驗前取出標本，在常溫下解凍后，用骨刀沿膝關(guān)節(jié)軟骨的細微裂隙方向切取軟骨，修整成啞鈴形小試樣。用生理鹽水洗浴拉伸配件后，將關(guān)節(jié)軟骨標本兩端固定于MTS(萬能測試機)上準備實驗。①應(yīng)力松弛測試：以5 mm/min拉伸韌帶，直至試樣長度的5%并維持不變。從t(0)開始釆集數(shù)據(jù)，采集間隔為0.1 s，采集時間為1 800 s。②蠕變測試：以5 mm/min進行拉伸，達到4 MPa時，停止拉伸，保持應(yīng)力4 MPa不變，開始釆集數(shù)據(jù)。計算機數(shù)據(jù)采集程序與應(yīng)力松弛測試相同。

2.2.3 膝關(guān)節(jié)軟骨細胞損傷程度、軟骨基質(zhì)蛋白多糖酵解程度改變 ①采用HE染色，評估軟骨細胞損傷程度改變，評估指標包括：軟骨厚度、表面纖維化程度、軟骨基質(zhì)黏液變性程度、軟骨細胞數(shù)目減少程度、軟骨細胞死亡程度、垂直線性裂隙、鈣化紊亂程度、軟骨細胞再生。②使用HE染色及番紅染色，評估軟骨基質(zhì)蛋白多糖酵解程度。

2.2.4 膝關(guān)節(jié)軟骨NF-κB、iNOS蛋白表達 采用Western blot檢測軟骨細胞NF-κB及iNOS蛋白表達水平。采用RIPA蛋白裂解法提取關(guān)節(jié)軟骨組織的總蛋白，按BCA法檢測iNOS蛋白含量，上樣后行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；通過電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，3%BSA封閉l h，加入一抗后置于4 ℃冰箱過夜；洗膜，加入二抗室溫孵育2 h，再洗膜，加入ECL顯色試劑，曝光，顯影。Western Blot結(jié)果采用Bandscan5.0軟件行結(jié)果分析。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 兩組患者治療前后HSS評分比較 見表1。

表1 兩組患者治療前后HSS評分比較分)

3.2 兩組患者軟骨應(yīng)力松弛與蠕變測試結(jié)果比較 見表2。

表2 兩組患者軟骨應(yīng)力松弛與蠕變測試結(jié)果比較

3.3 兩組患者軟骨細胞損傷程度、軟骨基質(zhì)蛋白多糖酵解程度改變比較 見圖1～圖2。

圖1 兩組患者軟骨細胞損傷程度改變比較

圖2 兩組患者軟骨基質(zhì)蛋白多糖酵解程度比較

3.4 兩組患者軟骨細胞NF-κB、iNOS蛋白表達水平比較 見圖3。

注：與A組比較，*P<0.05圖3 兩組患者軟骨細胞NF-κB及iNOS蛋白表達Western blot 檢測結(jié)果

4 討論

目前，關(guān)于KOA的發(fā)病機制有多種學說，包括軟骨細胞凋亡、自身免疫反應(yīng)、軟骨下骨內(nèi)高壓、自由基、細胞因子學說等，認為是由內(nèi)外環(huán)境失衡及二者之間的相互影響、互為因果的生物過程導致KOA的發(fā)生，其中軟骨細胞功能不全對KOA的演變愈發(fā)引起重視[8]。膝關(guān)節(jié)是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜而最易受損傷的人體關(guān)節(jié)之一，其表面的關(guān)節(jié)軟骨作為一種多孔的黏彈性材料，可提供潤滑良好的關(guān)節(jié)面，同時其傳導分散應(yīng)力、抗壓等特性可保護關(guān)節(jié)骨骼對沖擊力的損傷[9]。因此，研究應(yīng)力應(yīng)變不僅對于了解膝關(guān)節(jié)軟骨傳遞載荷的特性十分必要，而且對于保護、修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨具有重要意義。

祖國醫(yī)學認為，KOA屬于“骨痹”“痹證”等范疇，其主要病機為經(jīng)絡(luò)氣血阻滯；內(nèi)在因素在于氣血營衛(wèi)內(nèi)虛，風寒濕邪外襲則是其外在因素?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩唬骸澳I氣盛，齒更發(fā)長，腎氣平均，故真牙生而長極。筋骨堅，發(fā)長極，筋骨勁強，肌肉滿壯?！薄端貑枴っ}要精微論》有記載：“膝者筋之府，屈伸不能，行則僂附，筋將憊矣?！庇纱丝梢?，腎虛不能主骨生髓；肝腎同源，腎虛則肝亦虛，肝虛則無以養(yǎng)筋以束骨、利關(guān)節(jié)；筋骨充養(yǎng)不足，則萎軟無力，逐漸演變?yōu)榻罟强菸霈F(xiàn)軟骨的退行性改變。推拿是中醫(yī)常用的手法，通過產(chǎn)生不同形式的動態(tài)力信號，作用于關(guān)節(jié)周圍感受器，發(fā)放動作電位并經(jīng)神經(jīng)中樞的整合與反饋，發(fā)揮手法的治療作用[10]。大量研究表明，拔伸類手法能夠擴大關(guān)節(jié)間隙，降低關(guān)節(jié)內(nèi)壓力，改善靜脈回流，降低骨內(nèi)壓，同時還有利于緩解肌張力，增加關(guān)節(jié)活動度，改善關(guān)節(jié)功能[11-12]。本研究結(jié)果也顯示，A組手法治療后HSS評分明顯高于B組 (P<0.05)，進一步證實中醫(yī)手法可有效改善KOA患者的疼痛、關(guān)節(jié)功能，提高生活質(zhì)量。周舒心等[13]報道稱，特色中醫(yī)手法可有效改善局部微循環(huán)，增加血管元氣和筋骨營養(yǎng)，增加骨生成，從而提高局部關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性。

本研究先行手法干預(yù)再行TKA術(shù)，剝離關(guān)節(jié)軟骨直接觀察，結(jié)果顯示，與B組比較，A組最大應(yīng)力明顯增加，而蠕變率、應(yīng)力松弛率則明顯降低 (P<0.05)，與程國杰等[14]研究結(jié)果相符，直接證實了機械外力干擾可導致軟骨細胞行為改變，手法治療對KOA的關(guān)節(jié)軟骨具有修復(fù)作用。手法通過對膝關(guān)節(jié)周圍肌肉、韌帶等軟組織的力學平衡調(diào)整打破KOA發(fā)生發(fā)展的惡性循環(huán)過程，達到治療關(guān)節(jié)軟骨退化的效果；但其具體分子生物學作用機制尚不十分清楚[15]。NF-κB是與炎癥、免疫等反應(yīng)相關(guān)細胞的信號轉(zhuǎn)導中樞及關(guān)鍵蛋白，在KOA滑膜組織、膝關(guān)節(jié)周圍肌肉中表達升高，同時高水平的NF-κB通過促進IL-1β、TNF-α等炎性因子表達，進而調(diào)控NO活性，促進軟骨細胞凋亡和軟骨破壞[16-17]。本組病例發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)手法治療后軟骨細胞NF-κB、iNOS相對表達量顯著降低 (P<0.05)；提示由NF-κB信號通路介導的手法可發(fā)揮KOA治療作用，手法治療可能參與了抑制NF-κB信號通路的活化，下調(diào)骨關(guān)節(jié)炎軟骨iNOS蛋白的表達，促進軟骨細胞增殖，從而保護骨關(guān)節(jié)軟骨。

綜上所述，中醫(yī)手法對KOA具有確切的臨床療效，可減輕關(guān)節(jié)疼痛和僵硬，改善關(guān)節(jié)功能，同時可通過NF-κB信號通路介導軟骨的修復(fù)作用，提示NF-κB信號通路有望成為抑制KOA炎癥反應(yīng)、保護關(guān)節(jié)軟骨新的分子靶點。