烏魯木齊地區(qū)不同健康狀態(tài)和飼養(yǎng)環(huán)境中寵物源沙門菌耐藥特征分析

軒慧勇，王凱，吾買爾江·牙合甫，高蕓，夏利寧

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

沙門菌是重要的人畜共患病原菌之一，可在一年中的任何時(shí)候引起人或動(dòng)物發(fā)病，導(dǎo)致感染率增加[1]。隨著社會(huì)的發(fā)展，寵物數(shù)量不斷增加，犬和貓?jiān)趯櫸锓N類里占據(jù)較大的比重，由于人與犬、貓之間的親密接觸，增加人畜共患病發(fā)生的可能性，即使是沒有任何癥狀的健康犬和/或貓，也可能通過糞便、尿液等傳播沙門菌，并通過環(huán)境感染給其他動(dòng)物和/或人[2-3]。隨著臨床上抗菌藥物的廣泛使用，寵物源沙門菌的耐藥性問題凸顯出來，高耐藥率和多重耐藥菌株的出現(xiàn)，導(dǎo)致人類和寵物沙門菌病的治療面臨難題[4]。隨著生活水平的提高，人們?cè)絹碓街铝τ趯櫸锔＠祟惛腥局委煹氖走x抗生素也常用于小動(dòng)物臨床[4]。目前我國并未建立小動(dòng)物細(xì)菌耐藥性監(jiān)測體系，無法指導(dǎo)小動(dòng)物臨床抗生素合理使用和評(píng)估寵物源細(xì)菌耐藥性傳遞到人類的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究采集不同飼養(yǎng)環(huán)境和不同健康狀態(tài)下寵物的肛拭子樣，從中分離沙門菌，進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)與耐藥基因檢測，從而了解該地區(qū)不同飼養(yǎng)環(huán)境和不同健康狀態(tài)下寵物源沙門菌的耐藥與耐藥基因流行現(xiàn)狀，加強(qiáng)耐藥菌株的監(jiān)測，減少耐藥菌株由寵物向人傳遞的幾率。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年7月對(duì)新疆烏魯木齊的6家寵物醫(yī)院和1家流浪動(dòng)物救助站進(jìn)行樣品采集(采集對(duì)象為犬和貓)，通過肛拭子在直腸采集樣品共307份，其中健康動(dòng)物糞樣234份，患病動(dòng)物糞樣73份，患病動(dòng)物主要為消化系統(tǒng)疾病，其次為呼吸系統(tǒng)疾病和外傷。

1.2 質(zhì)控菌株、培養(yǎng)基與試劑

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922購自天和微生物試劑有限公司(杭州)。麥康凱培養(yǎng)基、氯化鎂孔雀綠增菌液(rappaport-vassiliadis medium，MM)、MH(mueller-hinton)培養(yǎng)基和SS瓊脂均購自奧博星生物技術(shù)有限公司(北京)。

試劑：瓊脂糖膠回收試劑盒與EB染色液以及Marker Ⅱ、2×Tap PCR Master Mix，均購自天根生化科技有限公司(北京)；BstF5I酶購自NEB公司；瓊脂糖凝膠原產(chǎn)于西班牙。

1.3 沙門菌分離鑒定

從樣品管中吸取50 μL樣品至1 mL滅菌MM增菌液中，于37 ℃培養(yǎng)48 h后用滅菌接種環(huán)在SS瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，挑取中間黑色周圍透明的單菌落至1 mL MM增菌液中，增菌12 h后在沙門菌顯色培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)基上紫紅色單菌落并保存?zhèn)溆?。由生物工程股份有限公?上海)合成沙門菌管家基因invA引物，序列為：下游引物invA-R：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′，上游引物invA-F：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAA CC-3′，擴(kuò)增目的片段大小為284 bp[5]，對(duì)分離菌株進(jìn)行驗(yàn)證。將分離鑒定的沙門菌根據(jù)動(dòng)物的健康狀態(tài)分為健康動(dòng)物源與患病動(dòng)物源兩類；根據(jù)不同飼養(yǎng)環(huán)境將分離的沙門菌分為流浪動(dòng)物源與家養(yǎng)動(dòng)物源兩類。

1.4 藥敏試驗(yàn)

受試藥品：環(huán)丙沙星(CIP)、諾氟沙星(NOF)、恩諾沙星(ENR)、阿莫西林/克拉維酸(A/C)、頭孢噻呋(CEF)、氨芐西林(AMP)、安普霉素(APR)、阿米卡星(AMK)、硫酸慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KANA)、四環(huán)素(TE)、氟苯尼考(FLR)，上述藥品的標(biāo)準(zhǔn)品/對(duì)照品均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。運(yùn)用瓊脂稀釋法[6]，對(duì)分離鑒定出的沙門菌進(jìn)行抗菌藥物最小抑菌濃度(MICs)測定。

1.5 耐藥基因檢測

依據(jù)參考文獻(xiàn)[7-12]由生物工程股份有限公司(上海)分別合成β-內(nèi)酰胺酶基因(blaTEM、blaCTX-M、blaSHV、blaLAP-1、blaKPC、blaOXA和blaCMY-2)、PMQR因子(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、oqxB和aac(6′)-Ib)、四環(huán)素類基因(tetA和tetB)、氨基糖苷類基因(armA、rmtB、aadA2和ant(3″)-Ia)、酰胺醇類基因(floR)引物，待引物收到后先要對(duì)其進(jìn)行3 000 r/min離心2 min處理，再按引物說明要求進(jìn)行稀釋，完成之后對(duì)上述22種耐藥基因分別進(jìn)行PCR檢測。用BstF5I酶進(jìn)行酶切已檢出aac(6′)-Ib基因的PCR產(chǎn)物，如果存在-cr突變情況，那么aac(6′)-Ib基因?qū)⑹stF5I酶的限制性位點(diǎn)并出現(xiàn)不能被切割現(xiàn)象。再次通過觀察瓊脂糖凝膠電泳圖譜的條帶可以獲得aac(6′)-Ib基因中-cr有無突變現(xiàn)象。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

耐藥率差異統(tǒng)計(jì)采用SPSS 20.0軟件，用卡方檢驗(yàn)做差異性顯著分析，結(jié)果以平均值的形式表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同健康狀態(tài)和不同飼養(yǎng)環(huán)境中寵物源沙門菌分離鑒定

圖1為SS瓊脂培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后沙門菌生長情況。圖2為部分沙門菌PCR鑒定結(jié)果，挑取的疑似沙門菌均含有invA基因，且目的條帶單一明亮，無雜帶。

圖1 分離菌在SS培養(yǎng)基上生長狀態(tài)

M. DNA Marker Ⅱ；1～22. 寵物源疑似沙門菌；23. 陽性對(duì)照；24. 陰性對(duì)照?qǐng)D2 部分寵物源沙門菌invA基因檢測結(jié)果

從307株樣品中共分離出99株沙門菌，整體分離率為32.2%(99/307)。由表1可知，患病動(dòng)物沙門菌分離率(53.4%，39/73)顯著高于健康動(dòng)物沙門菌分離率(25.6%，60/234)(P<0.05)。此外，流浪動(dòng)物沙門菌分離率(78.4%，29/37)顯著高于家養(yǎng)動(dòng)物沙門菌分離率(25.9%，70/270)(P<0.05)。

表1 不同健康狀態(tài)和不同飼養(yǎng)環(huán)境的寵物源沙門菌分離結(jié)果

2.2 寵物源沙門菌的耐藥及多藥耐藥情況

99株寵物源沙門菌對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林和氟苯尼考這7種抗菌藥物的耐藥率依次為6.1%(6/99)、3.0%(3/99)、3.0%(3/99)、3.0%(3/99)、2.0%(2/99)、2.0%(2/99)和2.0%(2/99)；對(duì)頭孢噻呋、安普霉素、阿米卡星、硫酸慶大霉素和卡那霉素這5種抗菌藥物100%敏感。

多藥耐藥結(jié)果顯示，99株寵物源沙門菌多藥耐藥以0耐為主(91.9%，91/99)，1耐次之，占5.1%(5/99)。4耐菌株、5耐菌株和7耐菌株各檢出1株，檢出率為1.0%。

2.2.1 不同健康狀態(tài)寵物源沙門菌的耐藥及多耐情況

由表2可知，健康寵物源沙門菌對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林和氟苯尼考這7種抗菌藥物的耐藥率均為1.7%(1/60)；患病寵物源沙門菌對(duì)四環(huán)素耐藥率最高為12.8%(5/39)，對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星和恩諾沙星的耐藥率均為5.2%(2/39)，對(duì)阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林和氟苯尼考這3種抗菌藥物的各檢出1株耐藥菌株，耐藥率為2.6%(1/39)；不同健康狀態(tài)寵物源沙門菌對(duì)頭孢噻呋、安普霉素、阿米卡星、慶大霉素和卡那霉素這5種抗菌藥物100%敏感。

表2 不同健康狀態(tài)寵物源沙門菌對(duì)12種抗菌藥物的耐藥情況 %

多藥耐藥結(jié)果顯示：健康動(dòng)物多藥耐藥以0耐為主(95%，57/60)，檢出2株1耐(3.3%，2/60)菌株和1株5耐菌株(1.7%，1/60)；患病動(dòng)物多藥耐藥以0耐為主(87.1%，34/39)，檢出3株1耐菌株，占7.7%(3/39)，4耐菌株和7耐菌株各檢出1株，檢出率均為2.6%(1/39)。

2.2.2 不同飼養(yǎng)環(huán)境寵物源沙門菌的耐藥及多耐情況

由表3可知，流浪寵物源沙門菌對(duì)被檢的12種抗菌藥物100%敏感，無耐藥菌株檢出；家養(yǎng)寵物源沙門菌對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林和氟苯尼考這7種抗菌藥物的耐藥率依次為8.6%、4.3%、4.3%、4.3%、2.9%、2.9%和2.9%。

表3 不同飼養(yǎng)環(huán)境寵物源沙門菌對(duì)12種抗菌藥物的耐藥情況 %

多藥耐藥結(jié)果顯示：流浪動(dòng)物寵物源沙門菌因無耐藥菌株檢出，故多藥耐藥為0耐(100.0%，29/29)；家養(yǎng)動(dòng)物多藥耐藥以0耐為主(88.6%，62/70)，1耐次之，占7.1%(5/70)，4耐菌株、5耐菌株和7耐菌株各檢出1株，檢出率均為1.4%(1/70)。

2.3 寵物源沙門菌耐藥表型與耐藥基因型

寵物源沙門菌耐藥基因檢測結(jié)果如下：對(duì)floR的檢出率為3.0%(3/99)；ant(3″-Ia、tetA、tetB檢出率均為2.0%(2/99)；blaTEM、oqxA、aac(6′)-Ib檢出率均為1.0%(1/99)，對(duì)aac(6′)-Ib的PCR產(chǎn)物用BstF5I酶進(jìn)行酶切，存在-cr變異，未檢出其他被檢耐藥基因。

耐藥率與耐藥基因檢出率比較發(fā)現(xiàn)，耐藥率稍高于耐藥基因檢出率，如對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥率為4.0%(4/99)，但相應(yīng)基因檢出率為1.0%(1/99)；對(duì)喹諾酮類耐藥率為9.1%(9/99)，相應(yīng)耐藥基因檢出率為2.0%(2/99)；對(duì)四環(huán)素類耐藥率為6.0%(6/99)，相應(yīng)耐藥基因檢出率為4.0%(4/99)；對(duì)酰胺醇類耐藥率為2.0%(2/99)，耐藥基因檢出率為3.0%(3/99)；未檢出氨基糖苷類耐藥菌株，卻檢出2株氨基糖苷類耐藥基因。由此可見，耐藥率與耐藥基因檢出率基本一致。

耐藥基因共存統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，僅有2株沙門菌同時(shí)攜帶ant(3″)-Ia、tetA和tetB3種耐藥基因。檢測結(jié)果詳見表4，PCR產(chǎn)物電泳見圖3。

表4 沙門菌耐藥基因檢測結(jié)果 %

1～3. floR；4～5. tetA；6. oqxA；7. blaTEM；8. aac(6′)-Ib；9～10. ant(3″)-Ia；11～12. tetB；+. 陽性對(duì)照；-. 陰性對(duì)照；M. DNA Marker圖3 寵物源沙門菌耐藥基因PCR檢測

3 討論

3.1 不同健康狀態(tài)和飼養(yǎng)環(huán)境寵物源沙門菌分離情況分析

本試驗(yàn)結(jié)果中寵物源沙門菌的分離率為32.2%(99/307)，略低于林亞軍等[13]報(bào)道的犬源沙門菌分離率(48.1%)，高于陳傳榮[2]報(bào)道的寵物犬沙門菌分離率(2.3%)。不同健康狀態(tài)寵物源沙門菌的分離結(jié)果顯示，患病動(dòng)物沙門菌分離率(53.4%)顯著高于健康動(dòng)物沙門菌分離率(25.6%)，分離率高于盛賢均等[14](健康動(dòng)物沙門菌分離率為0，患病動(dòng)物沙門菌分離率為20.0%～40.0%)和龔大春等[15](患病動(dòng)物沙門菌分離率為27.8%)的報(bào)道。不同健康狀態(tài)沙門菌分離結(jié)果顯示，動(dòng)物患病時(shí)會(huì)攜帶更多的沙門菌，可能增大沙門菌在動(dòng)物間的傳播幾率。

不同飼養(yǎng)環(huán)境寵物源沙門菌分離結(jié)果顯示，流浪動(dòng)物沙門菌分離率(78.4%)顯著高于家養(yǎng)動(dòng)物沙門菌分離率(25.9%)，與廖志偉等[16]報(bào)道結(jié)果一致，即流浪動(dòng)物沙門菌分離率(16.0%)高于家養(yǎng)動(dòng)物沙門菌分離率(7.4%)。流浪動(dòng)物會(huì)接觸其他各種各樣動(dòng)物及其糞便，但又不能及時(shí)清潔，因而流浪動(dòng)物糞便中沙門菌的分離率更高。

3.2 不同健康狀態(tài)和飼養(yǎng)環(huán)境寵物源沙門菌耐藥結(jié)果分析

本試驗(yàn)中寵物源沙門菌整體耐藥情況不嚴(yán)重，對(duì)被檢抗菌藥物的耐藥率在0～6.1%，對(duì)四環(huán)素耐藥率最高(6.1%)，耐藥結(jié)果低于部分報(bào)道，如：陳傳榮[2]報(bào)道的17株寵物犬源沙門菌耐藥率在0～35.29%之間；Songsak等[17]報(bào)道的122株寵物源沙門菌耐藥率在0.8%～100%；王元蘭[18]報(bào)道的寵物犬沙門菌耐藥率在3.6%～27.6%之間。不同地區(qū)寵物源沙門菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率差異較大，可能與動(dòng)物個(gè)體的健康狀態(tài)和用藥頻率有關(guān)；其次，不同寵物醫(yī)院使用的抗菌藥物及用藥療程不同也可能是造成寵物源沙門菌耐藥率差異大的原因之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)，患病動(dòng)物源菌株的耐藥率高于健康動(dòng)物源菌株的耐藥率，可能是對(duì)患病動(dòng)物進(jìn)行治療的過程中，抗菌藥物的使用導(dǎo)致患病動(dòng)物源菌株的耐藥率升高。此外，流浪動(dòng)物沙門菌的耐藥率顯著低于家養(yǎng)動(dòng)物沙門菌耐藥率，但流浪動(dòng)物沙門菌分離率卻顯著高于家養(yǎng)動(dòng)物，分析原因可能是流浪動(dòng)物接觸抗菌藥物的機(jī)會(huì)少，流浪動(dòng)物被沙門菌侵襲后，無用藥機(jī)會(huì)，多靠自身抵抗力恢復(fù)，所以流浪動(dòng)物雖然沙門菌攜帶率較高，但這些沙門菌因?yàn)闆]有用藥而對(duì)被檢抗菌藥物敏感；而家養(yǎng)動(dòng)物接觸抗菌藥物機(jī)會(huì)多且用藥次數(shù)多，細(xì)菌在用藥壓力下可通過改變自身的代謝途徑或耐藥基因發(fā)生突變，導(dǎo)致藥物活性被抑制或失活，從而表現(xiàn)出耐藥或多藥耐藥[4]。

多藥耐藥結(jié)果顯示，烏魯木齊市寵物源沙門菌多藥耐藥主要集中在0耐(91.9%)和1耐(5.1%)，結(jié)果低于林亞軍等[13]報(bào)道的寵物源沙門菌8耐及以上耐藥菌株占97.4%；多藥耐藥結(jié)果遠(yuǎn)低于其他動(dòng)物源沙門菌多藥耐藥結(jié)果，如陳玲等[19]報(bào)道的動(dòng)物源沙門菌多重耐藥率高達(dá)63.75%，關(guān)茹飛等[20]報(bào)道的雞源沙門菌的多藥耐藥結(jié)果11耐占15.0%。寵物源沙門菌多藥耐藥率低于其他動(dòng)物源沙門菌多藥耐藥率，原因可能與寵物的生活環(huán)境有關(guān)，使其感染沙門菌的幾率較小。此外，寵物從發(fā)病、用藥到護(hù)理都能夠得到主人的關(guān)注，濫用藥物的機(jī)會(huì)少，可能也是寵物源沙門菌多藥耐藥率較低的原因之一。

3.3 寵物源沙門菌耐藥基因結(jié)果分析

本試驗(yàn)?zāi)退幓驒z出率非常低，對(duì)酰胺醇類耐藥基因floR檢出率最高，也僅為3.0%(3/99)，低于黃凱等[21](動(dòng)物源floR檢出率為13.1%)和任士飛等[22](鴨源floR檢出率為30.6%)的報(bào)道。對(duì)四環(huán)素類和氨基糖苷類耐藥基因檢出率均為2.0%，遠(yuǎn)低于軒慧勇等[23]寵物源tetB(100.0%)的檢測結(jié)果，但與侯雪嬌等[24]報(bào)道的食源性沙門菌tetB(3.5%)檢出率大致相同。本試驗(yàn)寵物源沙門菌并沒有檢出氨基糖苷類藥物耐藥菌株，卻檢出氨基糖苷類耐藥基因ant(3″)-Ia，相關(guān)資料表明，細(xì)菌對(duì)一種藥物的耐藥可能是幾種耐藥基因和耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果[3]，分析耐藥基因ant(3″)-Ia可能不是介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥主導(dǎo)基因。

此外，PMQR因子和β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因檢出率均為1.0%，低于林居純等[25]和黃巾凌等[26]報(bào)道的PMQR因子檢出率(oqxA檢出率在7.9%～24.6%，aac(6′)-Ib-cr檢測率在15.2%～27.5%)。Robicsek等[27]研究發(fā)現(xiàn)，aac(6′)-Ib-cr基因所介導(dǎo)的耐藥發(fā)生率明顯高于qnr基因介導(dǎo)的耐藥發(fā)生率，而aac(6′)-Ib-cr與其他PMQR因子共存現(xiàn)象更容易被檢測出來，從而使細(xì)菌獲得更高水平的耐藥，該研究結(jié)論可印證本試驗(yàn)PMQR因子耐藥基因檢出結(jié)果。本研究僅檢出1株攜帶blaTEM基因的沙門菌，該菌株來源于患有犬瘟熱的寵物犬，推測在治療過程中，為防止病毒與細(xì)菌的交叉感染，采用β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物進(jìn)行治療，進(jìn)而導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

新疆烏魯木齊市患病寵物源沙門菌的分離率及耐藥率高于健康寵物源沙門菌，流浪寵物源沙門菌的耐藥率低于家養(yǎng)寵物源沙門菌，所有菌株對(duì)被檢藥物的耐藥率均未超過10.0%，耐藥基因檢出率低，且耐藥表型與耐藥基因型之間呈正相關(guān)。結(jié)果提示，該地區(qū)寵物源沙門菌對(duì)被檢抗菌藥物具有較好的敏感性，故臨床上仍可使用頭孢菌素類和氨基糖苷類抗菌藥物用于犬、貓沙門菌病的治療。