細鱗魚溫和氣單胞菌LAMP檢測方法的建立

郭玉丹，杜迎春，何亞鵬，時曉，賈斌*

(1. 石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003；2. 北京市水生野生動植物救護中心，北京 102100)

細鱗魚(Brachymystaxlenok)屬鮭形目(Salmoniformes)、鮭形科(Salmonidae)、鮭亞科 (Salmoninae)、細鱗魚屬(Brachymystax)，是我國名貴的陸封型冷水魚[1]。細鱗魚又名小紅魚(新疆)，細鱗子(東北)，花魚(山西)，化魚(河北)，含脂率達3.8%～7%且無肌間刺，自宋朝時就作為貢品[2-3]。

近年來由于人類肆意濫捕濫撈、筑壩攔湖、截河漂流、旅游活動增加等人為因素導致細鱗魚數(shù)量急劇下降[4-5]。為維持種群延續(xù)和水域生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性，細鱗魚的人工馴養(yǎng)日益重要。溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)是多種淡、海水養(yǎng)殖魚類的一種重要病原菌，是魚類條件致病菌，如在水質(zhì)不佳、水溫上升等應激下，可引起水生動物大規(guī)模發(fā)病[6-11]，常與嗜水氣單胞菌混合感染[12]，可導致魚敗血癥、潰瘍腐爛[13-14]。感染魚離群獨居、水體打轉(zhuǎn)、攝食減少、鰭部出血，剖開魚體大多呈現(xiàn)肝腎出血、腹部膨脹有積水，且人吃了該菌感染的魚后會引發(fā)腹瀉、敗血病[15-16]。本試驗從患病魚體內(nèi)分離得到1株菌，經(jīng)過細菌鑒定確定為溫和氣單胞菌，在此基礎上選擇該菌高表達管家基因zipA作為目的基因設計篩選最佳引物，建立一種快速檢測該菌的環(huán)介導恒溫擴增技術(LAMP)，為該菌檢測提供工具。

1 材料與方法

1.1 材料

馴養(yǎng)車間患病細鱗魚若干尾，用于細菌分離鑒定；試驗所用中間氣單胞菌(ATCC33907)、豚鼠氣單孢菌(ATCC15468)、殺鮭氣單胞菌(ATCC27013)為北京水生野生動植物救護中心實驗室保存。

細菌微量生化鑒定管(北京陸橋技術股份有限公司)，BstDNA鏈置換聚合酶及緩沖液Buffer(美國紐英倫生物技術)，細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司出品)，SYBER Green I核酸染料(北京百泰克生物技術有限公司)，引物稀釋液TE(Solarbio)，電泳液(上海生工)，2×ESTaqMaster Mix(康維世紀)，瓊脂粉(北京蘭伯瑞生物技術有限公司)。

1.2 細菌分離

在無菌操作臺下，取患病魚腸積液涂布在固體LB培養(yǎng)基上劃線，在28 ℃培養(yǎng)12～24 h。待長出菌落后，挑取優(yōu)勢菌落，放入LB培養(yǎng)基中搖菌后再次劃線傳代，純培養(yǎng)，一部分用于基因組提取，一部分甘油保存于-80 ℃冰箱，另取單個菌落進行革蘭染色。

1.3 細菌鑒定

1.3.1 常規(guī)鑒定

選用24項生化鑒定指標，采用菌懸液法，用接種針從平板上挑取單個菌落至無菌水中，仔細研磨至0.5麥氏濁度的均一菌懸液分別滴入所選的安瓿瓶中，每瓶3滴，置于28 ℃培養(yǎng)。

1.3.2 16S rRNA序列分析

16S rRNA通用引物 P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′P2：5′-ACGGCTACCTTGTTACGATCT-3′進行常規(guī)PCR擴增。PCR反應體系為：無酶ddH2O水8.5 μL、模板2 μL、10 μmol/L引物各1.5 μL、2×EsTaqMasterMix(Dye)12.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min； 94 ℃ 變性30 s，56 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸45 s，共 35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。應用 DNAStar 等生物信息學軟件進行序列同源性比對和系統(tǒng)進化分析。

1.4 LAMP引物設計

選溫和氣單胞菌zipA基因作為靶基因，利用在線引物設計軟件Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)設計完成(表1)。共設計好5套引物，設計好的引物提交華大公司進行合成。其中F3 和B3為外引物，F(xiàn)IP和BIP為內(nèi)引物，LF和LB為環(huán)引物。

表1 溫和氣單胞菌LAMP引物序列

1.5 LAMP反應體系的優(yōu)化

對內(nèi)外引物濃度比例、dNTPs體積、Mg2+體積、反應溫度和擴增時間進行優(yōu)化。引物比例的優(yōu)化：內(nèi)外引物的比例為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、 5∶1 、 6∶1 、7∶1 、 8∶1 ；MgSO4體積的優(yōu)化：所加的MgSO4量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 μL；dNTPs的優(yōu)化：所加的dNTPs量為0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 μL；溫度的優(yōu)化：擴增溫度為61.5 ℃、62.5 ℃、63.5 ℃、64.5 ℃、65.5 ℃。LAMP反應條件和體系都在前一步優(yōu)化的基礎上進行反應，恒溫水浴鍋孵育，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察電泳是否有良好的梯形條帶，結(jié)合反應液渾濁度和顏色反應來確定最佳條件和體系。

1.6 LAMP 特異性試驗

按照上述1.5優(yōu)化的LAMP反應條件和體系，首先試劑盒提取中間氣單胞菌ATCC33907、豚鼠氣單孢菌ATCC15468、殺鮭氣單胞菌ATCC27013的DNA作為模板，檢測LAMP引物的特異性，設置ddH2O為模板空白對照，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 LAMP 靈敏度分析

以10倍稀釋法倍比稀釋DNA模板進行LAMP靈敏性試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離

患病魚體內(nèi)分離得到1株菌株，命名為AS，革蘭染色反應為紅色桿菌，兩端鈍圓。在麥康凱和普通LB培養(yǎng)基上均生長良好。

2.2 細菌鑒定

生理生化特性分析結(jié)果見表2，菌株AS的特性與溫和氣單胞菌一致。圖1顯示使用16S rRNA引物擴增出1 500 bp左右條帶，應用MegAlign 和MEGA6等軟件對進行序列比對和系統(tǒng)進化分析，分離菌AS的16S rRNA基因序列與溫和氣單胞菌JCM2139相應序列(NR112837.1)同源性達 100%，且與溫和氣單胞菌菌株208和菌珠JCM2139位于同一進化分枝(圖2)。綜合如上鑒定結(jié)果，確定本次分離菌為溫和氣單胞菌。

表2 分離菌株的生化結(jié)果

M. DL2000 DNA Marker; 1. 空白對照；2. 菌株AS圖1 分離菌 16S rRNA基因PCR擴增結(jié)果

注：●為本試驗分離菌株圖2 分離菌株與參考菌株16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 LAMP引物的篩選

LAMP擴增后，首先用肉眼觀察渾濁沉淀，發(fā)現(xiàn)反應管2和3中均有渾濁，其余管中無渾濁(圖3A)；添加1 μL SYBER Green I核酸染料，反應管2和3顏色由橙色變?yōu)辄S綠色，其余管不變色(圖3B)。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，盡管第2套引物有渾濁也有顏色反應，但條帶不是很清晰(見圖3C)。綜合三項的結(jié)果選擇第1套引物1ZF3～1ZLF。

A：濁度；B：加入SYBER Green I核酸染料顏色變化；C：瓊脂糖凝膠電泳M. DL2000 DNA Marker；1.空白對照；2.第1套引物(1ZF3～1ZLF)；3.第2套引物(2ZF3～2ZLB)；4.第3套引物(3ZF3～3ZLB)；5.第4套引物(4ZF3～4ZLF)；6.第5套引物(2ZF3～2ZBIP)圖3 LAMP擴增引物篩選

2.4 LAMP反應體系的優(yōu)化

對內(nèi)外引物濃度比例、dNTPs體積、Mg2+體積、反應溫度和擴增時間進行優(yōu)化，確定最佳擴增溫度是：63.5 ℃，最佳體系內(nèi)外引物比例3∶1，dNTPs體積為3.5 μL，Mg2+體積2 μL。

2.5 LAMP特異性試驗

溫和氣單胞菌DNA反應結(jié)果為陽性，肉眼觀察反應物呈黃綠色，殺鮭氣單胞菌等對照菌株反應物呈橙色(染料本身的顏色)且無條帶，反應為陰性，說明LAMP方法的特異性良好(見圖4)。

A：濁度；B：加入SYBER Green I核酸染料顏色變化；C：瓊脂糖凝膠電泳M. DL2000 DNA Marker;1.無菌水；2. 溫和氣單胞菌AS;3. 殺鮭氣單胞菌ATCC27013;4. 豚鼠氣單胞菌ATCC15468;5. 中間氣單胞菌ATCC33907圖4 溫和氣單胞菌基因組LAMP方法的特異性

2.6 LAMP靈敏性試驗

用分光光度計測得溫和氣單胞菌DNA的濃度為166.3 ng/μL，對DNA進行10倍倍比稀釋后，分別用10-13至10-2倍DNA為模板，進行LAMP反應，可以看到在1.663×10-9ng/μL時梯形條帶足夠清晰(見圖5)，確定最低檢出濃度是1.663×10-9ng/μL。

M. DL2000 DNA Marker；1.空白對照；2～13.10-13～10-2連續(xù)10倍倍比稀釋的核酸圖5 LAMP方法檢測核酸的靈敏度

3 討論

溫和氣單胞菌在水生生態(tài)系統(tǒng)中無處不在，存在于污水、地表水、動物和人類糞便、食品、健康或患病魚中，能夠引起魚類和人類感染[17-18]。目前，檢測菌種的方法有鑒別培養(yǎng)基、聚合酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)方法等[19-21]，這些檢測方法所需時間至少2 d；在食品檢測中，該菌還未列入常規(guī)的致病菌檢測范圍，實驗室的分離鑒定還沒有國家標準[22]。LAMP是2000年由日本學者Notomi發(fā)明的一種擴增DNA的檢測技術，可在1 h之內(nèi)通過鏈置換得到109倍的基因[23]，縮短了反應時間。2018年張新艷[24]根據(jù)溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌的上游序列不同，設計出可擴增該上游特異性片段的引物，將溫和氣單胞菌與其他的近似菌種分開，結(jié)果證明建立的檢測方法靈敏度高，特異性好。

本試驗篩選zipA基因設計特異性LAMP引物。zipA基因作為氣單胞菌屬細菌的管家基因，主要呈現(xiàn)分裂細菌的功能，該基因特定編碼序列和內(nèi)含子未翻譯區(qū)較短，短基因重復序列數(shù)高于長基因重復序列數(shù)，具有在任何細胞表達不受影響和連續(xù)被轉(zhuǎn)錄的功能。表達均數(shù)是1 200，是其他基因的8倍，保守性高、表達量高，在做系統(tǒng)發(fā)育樹時，可用來彌補16S rRNA基因的信息量少局限性，能更好地區(qū)分屬內(nèi)物種[25]。依靠BstDNA 聚合酶作反應的動力，結(jié)果采用肉眼觀察渾濁度、顏色變化、梯形條帶這3種判斷方式互相印證，具有較高可信度，建立的該方法在實驗室保存的幾種細菌間具有良好特異性。LAMP檢測技術在引物篩選、優(yōu)化方式和結(jié)果判定上已有深入的研究[26-27]，與實時熒光定量 PCR 方法[28]相比，克服了重復的熱變性并縮短了反應時間。

綜上，本試驗分離鑒定了細鱗魚溫和氣單胞菌，在此基礎建立了環(huán)介導恒溫擴增快速檢測方法，為細鱗魚溫和氣單胞菌感染的診斷提供了參考。