家禽糞便環(huán)境對(duì)常用消毒劑滅活H5N6亞型禽流感病毒的影響

秦濤，汪川韋，鄭淑媚，張佳琦，朱閩，陳素娟，彭大新

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

在2010年以前，我國主要流行的是H5N1亞型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)，而2010年之后，家禽中又陸續(xù)出現(xiàn)了H5Nx亞型AIV的流行[1-3]。自2013年以來，H5N6亞型高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)已逐漸取代H5N1亞型HPAIV成為目前我國家禽主要流行株[4-5]。另外近年來有感染人的事件發(fā)生，嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生健康。疫苗接種雖能有效地控制HPAIV，但是在抗體選擇壓力下，病毒的變異速度加快，導(dǎo)致疫苗的免疫效果失敗，因此僅僅依賴疫苗并不是最有效的防控手段[6]。很多學(xué)者及從業(yè)者逐步認(rèn)識(shí)到養(yǎng)禽場和活禽交易市場的防疫核心仍然是生物安全體系的建設(shè)，其中消毒技術(shù)體系是最基礎(chǔ)但最不容忽視的環(huán)節(jié)。養(yǎng)禽場和活禽交易市場存欄禽規(guī)模較大，產(chǎn)生的糞便體量較大，特別是活禽交易市場，存在環(huán)境和器具等清潔不徹底導(dǎo)致糞便殘留等問題。H5N6亞型AIV主要通過糞口途徑傳播，糞便排毒常見，可見如何保障有效殺滅家禽殘留糞便中的病毒是阻斷傳播的關(guān)鍵。但按照常用消毒劑說明書的推薦濃度是否能有效殺滅病毒目前尚不明確。因此，本試驗(yàn)在家禽糞便環(huán)境下評(píng)估了5種常用的化學(xué)消毒劑對(duì)我國H5N6亞型HPAIV流行株的滅活效果，為科學(xué)合理地選擇養(yǎng)禽場和活禽交易市場消毒劑種類和劑量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與毒株

犬腎細(xì)胞(madin-darby canine kidney，MDCK)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中。A/Goose/Anhui/AHG0419/2016(H5N6)禽流感病毒，由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.2 主要試劑

5種消毒劑分別為：過硫酸氫鉀復(fù)合物、二氯異氰脲酸鈉、戊二醛癸甲溴銨、癸甲溴銨和戊二醛苯扎溴銨。按照說明書，過硫酸氫鉀復(fù)合物的推薦濃度：針對(duì)AIV的使用濃度為0.062 5%，法氏囊病毒的使用濃度為0.25%，水產(chǎn)養(yǎng)殖的使用濃度為0.5%。疫源地消毒時(shí)，二氯異氰脲酸鈉的推薦使用濃度為0.2 g/L，戊二醛癸甲溴銨的推薦使用濃度為0.2%～0.1%，癸甲溴銨的推薦使用濃度為0.015%～0.05%，戊二醛苯扎溴銨的推薦使用濃度為1%。所有消毒劑使用的標(biāo)準(zhǔn)硬水(硬度342 mg/L)[7]，由氯化鎂(MgCl2·6H2O，0.139 g)和氯化鈣(CaCl2，0.034 g)加蒸餾水至1 L配制。

各消毒劑所對(duì)應(yīng)的中和劑[8]：過硫酸氫鉀復(fù)合物和二氯異氰脲酸鈉的中和劑為0.2 mol/L硫代硫酸鈉(國藥集團(tuán))；戊二醛癸甲溴銨的中和劑為0.1%甘氨酸(Biosharp)+0.3%吐溫80(BioFRoxx)；癸甲溴銨的中和劑為0.1%甘氨酸+0.3%吐溫80+0.03%卵磷脂(國藥集團(tuán))；戊二醛苯扎溴銨的中和劑為0.05%甘氨酸+0.4%吐溫80。

1.3 中和劑鑒定試驗(yàn)

1.3.1 中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)H5N6亞型AIV在MDCK細(xì)胞中增殖的影響

依據(jù)衛(wèi)生部頒布的《消毒技術(shù)規(guī)范》[7]，評(píng)估糞便、中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)病毒滴度的影響。試驗(yàn)共分為9組：第1組是消毒劑+病毒懸液；第2組是(消毒劑+病毒懸液)+中和劑；第3組是中和產(chǎn)物(消毒劑+中和劑)+病毒懸液；第4組是(硬水+病毒懸液)+中和劑；第5組是(硬水+病毒懸液)+PBS；第6組是(糞便+硬水+病毒懸液)+中和劑；第7組是(糞便+硬水+病毒懸液)+雙抗PBS；第8組是(硬水+病毒懸液)+硬水+雙抗PBS；第9組是硬水+PBS，作為不接病毒對(duì)照組。試驗(yàn)結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：第1組無試驗(yàn)病毒或有少量病毒；第2組較第1組為病毒稍多或相近數(shù)量，但較第3、4、5、6、7和8組顯著減少；第3、4、5、6、7和8組病毒數(shù)量與原接種量相近，第9組細(xì)胞生長正常。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 病毒滅活試驗(yàn)

依據(jù)衛(wèi)生部頒布的《消毒技術(shù)規(guī)范》[7]，用標(biāo)準(zhǔn)硬水將消毒劑配制為雙倍濃度，吸取溶液0.5 mL于2個(gè)離心管中，置25℃水浴中5 min，再分別吸加0.5 mL病毒懸液(新鮮家禽糞便與尿囊液1∶1混勻后，25 ℃水浴鍋中放置30 min)，混勻并放回25℃水浴鍋。待作用一定時(shí)間(10 min、30 min、60 min)后，立即取出0.1 mL，加入含有雙抗的中和劑0.9 mL，混勻，作用30 min后，進(jìn)行10倍系列稀釋(101～108)，接種于MDCK細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，病毒的半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)按照Reed-Muench法進(jìn)行計(jì)算，平均滅活對(duì)數(shù)值按下式計(jì)算：設(shè)陽性(病毒)對(duì)照組平均TCID50的為N0，試驗(yàn)(消毒)組平均TCID50為Nx，平均滅活對(duì)數(shù)值=lgN0-lgNx，當(dāng)平均滅活對(duì)數(shù)值=lgN0時(shí)，視為病毒完全滅活。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)病毒滴度的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)所用的4種中和劑及其中和產(chǎn)物不影響MDCK細(xì)胞的生長狀況[9]。采用的9組試驗(yàn)方案結(jié)果表明，含0.4 mol/L的硫代硫酸鈉雙抗PBS可以有效中和1%過硫酸氫鉀復(fù)合物溶液以及3.2 g/L二氯異氰脲酸鈉溶液；含0.6%吐溫80+0.06%卵磷脂+0.2%甘氨酸的雙抗PBS可以有效中和 0.24%癸甲溴銨溶液；含0.6%吐溫80+0.2%甘氨酸的雙抗PBS可以有效中和2%戊二醛癸甲溴銨溶液；含0.8%吐溫80+0.1%甘氨酸的雙抗PBS可以有效中和0.8%戊二醛苯扎溴銨溶液；與病毒陽性對(duì)照組對(duì)比，加入中和劑及中和產(chǎn)物后，對(duì)病毒的滴度影響較小(見表1)。

表1 中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)病毒滴度(TCID50)的影響 lg

2.2 糞便環(huán)境對(duì)過硫酸氫鉀復(fù)合物殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無糞便環(huán)境下(對(duì)照組)，0.2%過硫酸氫鉀復(fù)合物溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.17±0.17)；在糞便環(huán)境下，該消毒劑需提高2.5倍用量，0.5%作用10 min才能將病毒完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.42±0.09)(見表2)。

表2 在不同環(huán)境下過硫酸氫鉀復(fù)合物溶液對(duì)H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.3 糞便環(huán)境對(duì)二氯異氰脲酸鈉殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無糞便環(huán)境下，濃度為0.4 g/L二氯異氰脲酸鈉溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.50±0.00)；在糞便環(huán)境下，該消毒劑需提高2倍用量，0.8 g/L濃度作用10 min才能將病毒完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.25±0.25)(見表3)。

表3 在不同環(huán)境下二氯異氰脲酸鈉溶液對(duì)H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.4 糞便環(huán)境對(duì)戊二醛癸甲溴銨殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無糞便環(huán)境下，0.25%戊二醛癸甲溴銨溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為4.75±0.25)；在糞便環(huán)境下，該消毒劑需提高4倍用量，1%作用延長至30 min才能將病毒完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為4.67±0.00)(見表4)。

表4 在不同環(huán)境下戊二醛癸甲溴銨溶液對(duì)H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.5 糞便環(huán)境對(duì)癸甲溴銨殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無糞便環(huán)境下，0.015%癸甲溴銨溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.17±0.25)；在糞便環(huán)境下，該消毒劑需提高8倍用量，0.12%作用延長至30 min才能將病毒完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.13±0.24)(見表5)。

表5 在不同環(huán)境下癸甲溴銨溶液對(duì)H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.6 糞便環(huán)境對(duì)戊二醛苯扎溴銨殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無糞便環(huán)境下，0.1%戊二醛苯扎溴銨溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.09±0.42)；在糞便環(huán)境下，該消毒劑需提高4倍用量，0.4%濃度作用10 min才能將病毒完全殺滅(滅活對(duì)數(shù)值為5.25±0.25)(見表6)。

表6 在不同環(huán)境下戊二醛苯扎溴銨溶液對(duì)H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

3 討論

本研究選擇了5種養(yǎng)殖場常用的消毒劑，評(píng)估在糞便環(huán)境下對(duì)各種消毒劑殺滅目前流行的H5N6亞型HPAIV的影響。結(jié)果表明，這5種消毒劑均受到家禽糞便環(huán)境的影響。與無糞便環(huán)境對(duì)比，殺滅糞便中H5N6亞型HPAIV，過硫酸氫鉀復(fù)合物溶液作用濃度需提高2.5倍，二氯異氰脲酸鈉溶液作用濃度需提高2倍，戊二醛癸甲溴銨溶液作用濃度需提高4倍，癸甲溴銨溶液作用濃度需提高8倍，戊二醛苯扎溴銨溶液作用濃度需提高4倍。相較而言，過硫酸氫鉀復(fù)合物溶液、二氯異氰脲酸鈉溶液受糞便的影響較??；戊二醛癸甲溴銨溶液與戊二醛苯扎溴銨溶液受糞便的影響較大，癸甲溴銨溶液受糞便的影響最大。與各消毒劑最大推薦濃度相比，過硫酸氫鉀復(fù)合物溶液、二氯異氰脲酸鈉溶液、戊二醛苯扎溴銨溶液在糞便環(huán)境下均可以有效滅活H5N6亞型HPAIV，而癸甲溴銨溶液、戊二醛癸甲溴銨溶液在糞便環(huán)境下均不能有效滅活H5N6亞型HPAIV，使用時(shí)需提高至最大推薦濃度以上。銀濤等[10]在對(duì)戊二酸消毒劑滅菌效果研究發(fā)現(xiàn)，通過添加有機(jī)物來影響消毒劑消毒效果，隨著消毒劑濃度的降低，有機(jī)物影響效果越明顯。糞便可以吸附并且中和消毒劑，阻礙了與病毒的直接接觸，從而顯著降低了消毒劑的活性，影響消毒效果。因此對(duì)于糞便殘留物的消毒，應(yīng)選用穿透力和氧化性強(qiáng)的消毒劑，例如二氯異氰脲酸鈉溶液等。