13株柔嫩艾美耳球蟲分離株對地克珠利及鹽霉素耐藥情況分析

黃杰，代幸如，殷邵杰，黃俊杰，劉明江，伯若楠，李金貴

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)是一種細(xì)胞內(nèi)頂復(fù)門寄生蟲[1]，臨床感染可引起雞的球蟲病，易造成死亡率高、耐過雞生長遲緩或繼發(fā)其他感染，對現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)危害十分嚴(yán)重[2]。該球蟲寄生于雞盲腸腸道上皮細(xì)胞內(nèi)，可引起雞腹瀉、血便、生長遲緩、飼料轉(zhuǎn)化率降低，雛雞感染可致大量死亡。目前，抗球蟲藥的使用是預(yù)防和治療球蟲病的常用手段之一。然而，大規(guī)模和長期使用導(dǎo)致雞肉等產(chǎn)品中殘留藥物并引起球蟲產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而影響公共健康和食品安全[3]。為更好地利用藥物，及時了解和評價抗球蟲藥對當(dāng)?shù)厍蛳x的治療效果以便指導(dǎo)生產(chǎn)，對雞球蟲病及球蟲抗藥性的調(diào)查、診斷、研究和分析是保護(hù)養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的必要前提。本試驗對不同地區(qū)臨床分離的13株柔嫩艾美耳球蟲進(jìn)行了地克珠利(DIC)以及鹽霉素(SAL)的藥物敏感性檢測，以期為這些地區(qū)防治雞球蟲病的用藥策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲珠

柔嫩艾美耳球蟲敏感株或標(biāo)準(zhǔn)株(SE)，由中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所贈送；來自江蘇、山東、福建、安徽、河南分離株共13株，具體情況見表1。

表1 各分離株分離情況

1.2 試驗動物

1日齡黃羽肉雞購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，試驗雞飼養(yǎng)于經(jīng)甲醛熏蒸消毒無球蟲雞舍中，飼喂飼料中不添加抗球蟲藥，飲水使用高壓滅菌水。

1.3 主要儀器及試劑

渦旋機(jī)WH-1；高速離心機(jī)(AnKe公司)；麥克馬斯特計數(shù)板(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所)；光學(xué)顯微鏡 (上海萊卡顯微鏡有限公司)。

胰蛋白酶，購自北京索萊寶科技有限公司；地克珠利溶液，購自天津市保靈動物保健品有限公司，批號20181003；12.96% 鹽霉素鈉預(yù)混劑，購自內(nèi)蒙古拜克生物有限公司，批號201705018。

1.4 耐藥性檢測試驗

試驗雞飼養(yǎng)至12日齡后稱重，并使用SPSS進(jìn)行隨機(jī)分組，體重記為試驗前體重。每個蟲株設(shè)DIC給藥組、SAL給藥組、感染不給藥對照組和不感染不給藥對照組，每組10只。除不感染不給藥組外，其他各組于14日齡分別接種各球蟲分離株孢子化卵囊105個。DIC給藥組1 mg/kg飲水給藥，SAL給藥組60 mg/kg拌料給藥，各給藥組均于13日齡時給藥。于接種后168 h將所有雞稱重后撲殺，體重記為試驗?zāi)w重。

1.5 盲腸病變計分及卵囊計數(shù)

感染后168 h將試驗雞剖殺，采取盲腸組織觀察其病變情況并記分，按Johnson等1970年的盲腸病變記分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定，組內(nèi)平均病變記分乘以10為該組病變值。收集各組盲腸組織，剪碎至1 mm3左右，加入1%胰酶置于37 ℃消化2 h，對各組盲腸勻漿中卵囊個數(shù)進(jìn)行計數(shù)，得到相應(yīng)卵囊值[4]。

1.6 耐藥性判定方法及標(biāo)準(zhǔn)

按照黃兵等[5]介紹的方法，以病變計分減少率(reduction of lesion scores, RLS)、相對卵囊產(chǎn)量(relative oocysts production, ROP)、最適抗球蟲活性百分率(percent of optimum anti-coccidial activity, POAA) 、抗球蟲指數(shù)(anti-coccidial index, ACI)等 4項指標(biāo)綜合判定不同蟲株對藥物的耐藥程度。計算公式如下：

ACI= (相對增重率+存活率)-(病變值+卵囊值)，ACI ≥160 判為陰性，ACI <160判為陽性，其中：增重=試驗?zāi)w重-試驗前體重，相對增重率=感染(不)給藥組增重/不感染不給藥組增重×100%。

RLS=(感染不用藥組平均病變計分-感染用藥組平均病變計分)/感染不用藥組平均病變計分×100%，RLS≥50% 判為陰性，RLS<50% 判為陽性。

ROP=感染用藥組平均卵囊百萬數(shù)/感染不用藥組平均卵囊百萬數(shù)×100%，其中ROP≥15% 判為陽性，ROP<15% 判為陰性。

POAA= (感染用藥組GSR-感染不用藥組GSR)/(不感染不用藥組GSR -感染不用藥組GSR)×100%，其中：GSR=籠末重/籠初重，POAA >50% 判為陰性，POAA≤50% 判為陽性。

在全部4項指標(biāo)中，全部為陰性判定為無耐藥性，1項為陽性判定為輕度耐藥，2項為陽性判定為中度耐藥，3～4項為陽性判定則為完全耐藥。

2 結(jié)果

2.1 DIC給藥組的各項指標(biāo)

2.1.1 不同地區(qū)球蟲分離株的ACI比較

根據(jù)表2可知，DIC對NT1、NT2、NT3、NT4、NT5、NT7以及HN球蟲株的ACI均小于160，耐藥性呈陽性，即在使用DIC治療的情況下，病雞臨床仍出現(xiàn)較為嚴(yán)重的血便癥狀，同時表現(xiàn)精神沉郁、閉眼縮頸、呆立不動等癥狀。對其余分離株的ACI均在170以上，臨床未見明顯球蟲病癥狀，剖檢可見盲腸僅有少量出血點，判為陰性。

表2 DIC對不同地區(qū)球蟲分離株的ACI

2.1.2 綜合耐藥性判定

根據(jù)表3可知，13株蟲株的綜合判定指標(biāo)中，NT1、NT2、NT3、NT4、NT5、HN株的4項指標(biāo)均為陽性，表現(xiàn)為完全耐藥；NT7株的4項指標(biāo)中有2項表現(xiàn)為陽性，判定為中等耐藥；SD3株的4項指標(biāo)中，有一項表現(xiàn)為陽性，判定為輕度耐藥；其余各株的4項指標(biāo)均表現(xiàn)為陰性，判定為無耐藥性。

表3 各地區(qū)蟲株對DIC綜合耐藥性的判定

2.2 SAL給藥組各項指標(biāo)

2.2.1 不同地區(qū)球蟲分離株的ACI比較

根據(jù)表4可知，使用SAL治療后，NT1、NT2、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、HN株的ACI均小于160，各組感染雞剖檢均可見盲腸顯著縮短，腸壁增厚，有明顯盲腸芯，判定為陽性；其余蟲株ACI均在160以上，感染雞臨床未見明顯球蟲病感染癥狀，判定為陰性。

表4 SAL對不同地區(qū)球蟲分離株的抗球蟲指數(shù)

2.2.2 綜合耐藥性判定

根據(jù)表5可知，在所收集并測試13株蟲株的指標(biāo)綜合判定中，NT1、NT2、NT4、NT5、NT6、NT7、HN株有3項指標(biāo)及以上均為陽性，表現(xiàn)為完全耐藥；NT3的4項指標(biāo)中有2項表現(xiàn)為陽性，判定為中等耐藥；其余各株的4項指標(biāo)均表現(xiàn)為陰性，判定為無耐藥性。

表5 各地區(qū)分離蟲株對SAL綜合耐藥性判定

3 討論

DIC是我國1997年批準(zhǔn)上市的抗球蟲藥物，最初投放使用時，臨床上僅需0.5～1 mg/kg的劑量即可達(dá)到非常好的防治效果。趙其平等[6]研究表明，1 mg/kg DIC對柔嫩艾美耳球蟲等5個艾美耳蟲種的ACI均達(dá)到180以上，始終在抗球蟲藥高效范圍內(nèi)，但應(yīng)用多年后陸續(xù)出現(xiàn)耐藥性的報道。在本試驗中，南通地區(qū)不同雞場有6株分離株對DIC均表現(xiàn)出強(qiáng)耐藥性，河南開封地區(qū)1株分離株表現(xiàn)完全耐藥，提示這些地區(qū)短時間內(nèi)不宜使用該藥物對球蟲進(jìn)行防治，應(yīng)采用其他藥物。

SAL是聚醚類離子載體抗生素的一種，有著較廣的抗球蟲譜，人們曾經(jīng)一度認(rèn)為離子載體類抗球蟲藥并不會使球蟲產(chǎn)生耐藥性，但是，由于離子載體類抗球蟲藥長期而又廣泛的使用，球蟲抗藥株的出現(xiàn)已很普遍[7]。本試驗中，南通分離株以及開封分離株均對SAL表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，提示該地區(qū)不適合使用SAL作為球蟲防治藥物，由于離子載體類抗生素作用機(jī)制類似，容易產(chǎn)生交叉耐藥性，所以同類藥物也不建議使用，可以選用其他種類藥物進(jìn)行防治。而其余地區(qū)分離株并沒有對本次檢測的2種藥物表現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥性，仍可以選用DIC或SAL對球蟲病進(jìn)行防治。

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，當(dāng)前球蟲感染情況依舊嚴(yán)峻[8]。而臨床養(yǎng)殖業(yè)對雞球蟲病的預(yù)防與治療基本依靠抗球蟲藥物的添加，但雞球蟲對幾乎所有的抗球蟲藥物都有對應(yīng)的耐藥蟲株出現(xiàn)。據(jù)黃儀娟等[9]報道，四川部分地區(qū)的球蟲分離株對多種常用抗球蟲藥，如：癸氧喹酯、莫能菌素、復(fù)方磺胺氯達(dá)嗪鈉等有著不同程度的耐藥性。劉瑞良[10]對湖南醴陵分離株進(jìn)行藥物敏感性試驗，結(jié)果顯示，鹽霉素、莫能菌素、二硝托胺等藥物對其無治療效果，表明分離株對多種藥物產(chǎn)生了耐藥性。大量文獻(xiàn)表明，雞球蟲耐藥性問題在我國普遍存在[11-14]。本試驗采集了來自不同地區(qū)共13株柔嫩艾美耳球蟲，各分離株均有使用過如磺胺氯吡氫鈉等磺胺類藥物進(jìn)行治療的用藥史，但臨床仍有發(fā)病表現(xiàn)，提示分離株可能對磺胺類藥物均有一定程度的耐藥性；而且南通分離株以及開封分離株均表現(xiàn)出對DIC以及SAL的耐藥性，說明部分臨床分離株有多重耐藥性，這可能與臨床長期使用同種藥物進(jìn)行防治有關(guān)。故臨床使用抗球蟲藥物時，應(yīng)注意藥物的交替使用以及聯(lián)合使用，保證治療效果同時有利于避免耐藥性的產(chǎn)生。崔怡等[15]研究表明，包膜丁酸鈉與癸氧喹酯聯(lián)用可以有效預(yù)防球蟲病，并對腸道有一定保護(hù)作用。另外，中藥由于其副作用相對較小，成分復(fù)雜不容易產(chǎn)生耐藥性，所以臨床利用中草藥對球蟲病進(jìn)行防治也有著良好的前景。