卵巢組織凍存移植安全性的研究進(jìn)展

程姣姣 阮祥燕* 杜 娟 金鳳羽 李揚(yáng)璐 谷牧青

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026)

由于腫瘤學(xué)、非腫瘤學(xué)和個(gè)人因素，女性對(duì)于生育力保護(hù)的需求急劇增加。卵巢刺激后成熟卵母細(xì)胞冷凍、胚胎凍存、卵巢組織凍存是美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)認(rèn)可的生育力保護(hù)方法[1-3]。卵巢組織凍存對(duì)于青春期前女孩以及性腺毒性治療無法延遲的女性是唯一的生育力保護(hù)方法[2-3]。全球已有超過200例嬰兒通過卵巢組織凍存移植技術(shù)誕生[4]，凍存卵巢組織移植后約95%患者的卵巢功能可恢復(fù)至正常，妊娠率可高達(dá)50%，活產(chǎn)率和持續(xù)妊娠率約40%[5]，這些數(shù)據(jù)[6]表明了卵巢組織凍存移植技術(shù)的有效性。

但對(duì)于白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、伯基特淋巴瘤等卵巢攜癌高風(fēng)險(xiǎn)的患者來說[7-9]，卵巢組織移植風(fēng)險(xiǎn)高，可能需要通過其他方法恢復(fù)生育力。一些團(tuán)隊(duì)[10-11]已經(jīng)為白血病患者進(jìn)行卵巢組織移植且患者成功分娩，未見報(bào)道疾病復(fù)發(fā)。近幾十年，為恢復(fù)生育力，并避免惡性細(xì)胞再移回體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)，世界各地的研究團(tuán)隊(duì)努力開發(fā)兩種技術(shù)[9, 12]：體外培養(yǎng)卵巢組織[13]和人工卵巢移植[14-15](transplantable artificial ovary, TAO)。第一個(gè)指的是在體外實(shí)現(xiàn)整個(gè)卵泡發(fā)生過程，第二個(gè)是將分離的竇前卵泡移植回體內(nèi)的自然環(huán)境。這些技術(shù)可提高所有凍存卵巢的患者的生育力。生育力保護(hù)體外技術(shù)的治療潛力是巨大的，但技術(shù)是有挑戰(zhàn)的。本文主要綜述凍存卵巢組織移植安全性以及避免惡性細(xì)胞再移回體內(nèi)新策略的研究進(jìn)展。

1 卵巢組織凍存與移植概述

2020年，中國新發(fā)癌癥患者470萬例，位居世界第一[16]。隨著腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療以及抗癌技術(shù)的進(jìn)步與提高，癌癥患者的5年生存率也明顯提高[17]。因此癌癥幸存者的生活質(zhì)量以及生育需求越來越得到重視。胚胎凍存、卵母細(xì)胞凍存、卵巢組織凍存等是常用的生育力保護(hù)技術(shù)。相比于胚胎凍存、卵母細(xì)胞凍存，卵巢組織凍存不需要超促排卵，不延誤患者后續(xù)的治療，一片組織中可凍存成百上千個(gè)卵泡，不僅可以保護(hù)患者的生育力，還可以保護(hù)患者的卵巢內(nèi)分泌功能[18]。此技術(shù)對(duì)于青春期前女童和放化療無法延遲的女性來說是唯一的生育力保護(hù)技術(shù)[2-3]。

通過卵巢組織凍存移植技術(shù)，全球首例及第2例嬰兒分別于2004年[19]和2005年[20]誕生。目前全球通過此項(xiàng)技術(shù)誕生的嬰兒已超過200例，近期本團(tuán)隊(duì)報(bào)道了中國首例患者應(yīng)用此技術(shù)后成功自然妊娠[21]。卵巢組織可移植回卵巢對(duì)應(yīng)的腹膜袋中、剩余的卵巢內(nèi)、剩余的卵巢上，可實(shí)現(xiàn)自然妊娠。如果盆腔經(jīng)歷大劑量的放射治療(以下簡稱放療)后血管供應(yīng)差，可考慮上臂、大腿、腹肌處的異位移植，但異位移植的成功率低，可能是環(huán)境溫度的不適應(yīng)。移植的卵巢組織活性平均可持續(xù)2～5年，目前報(bào)道最長7年[5]。卵巢組織的存活時(shí)間與患者凍存時(shí)的年齡以及當(dāng)時(shí)的卵巢儲(chǔ)備功能等有關(guān)。

成人卵巢組織凍存移植的適應(yīng)證中最常見的是血液惡性疾病(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病)和乳腺癌[2]。在兒童中，白血病和骨髓增生異常疾病往往占主導(dǎo)地位，其次是肉瘤[22]。到目前為止，還沒有出現(xiàn)與卵巢組織移植相關(guān)的復(fù)發(fā)病例，再次引入惡性細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)很低。因此，卵巢組織凍存移植技術(shù)是安全的，在目前的適應(yīng)證下不會(huì)對(duì)健康構(gòu)成威脅。

2 卵巢組織移植再攜入癌細(xì)胞的高風(fēng)險(xiǎn)疾病

對(duì)于患有白血病、伯基特淋巴瘤等疾病的患者，卵巢組織中存在惡性細(xì)胞或者微小殘留疾病(minimal residual disease, MRD)的可能性較高，尤其是在診斷時(shí)血液循環(huán)中有惡性細(xì)胞。多項(xiàng)研究[23-24]也已表明了白血病患者卵巢組織凍存、復(fù)蘇與移植攜癌風(fēng)險(xiǎn)很高。但目前卵巢組織凍存仍然是新診斷為白血病的患者保護(hù)生育力的主要策略，當(dāng)患者開始化學(xué)藥物治療(以下簡稱化療)后就不能采用胚胎或卵母細(xì)胞凍存了，但化療通常需要在診斷后立即開始。相比于凍卵，在化療開始后收集卵巢組織是可能的，因?yàn)榉巧L的卵泡是靜止的，對(duì)化療的致畸性損傷不敏感[25]。

已有研究[10]顯示，白血病幸存者可通過卵巢組織移植后分娩且沒有后續(xù)疾病復(fù)發(fā)。卵巢組織取材盡可能是在最安全的時(shí)間，一般傾向于完全緩解時(shí)。血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，在患者對(duì)治療出現(xiàn)反應(yīng)后，以及在疾病負(fù)擔(dān)或微小殘留疾病已大大減少時(shí)收集組織，可將卵巢組織的潛在惡性污染降至最低[26]。在一系列研究中，31例接受了凍融卵巢組織自體移植的患者中有22例(71%)在組織取材前有過化療暴露。自體卵巢組織移植后3年累積妊娠率總計(jì)為36%(95%CI為17.4～63.7)，其中49%的患者有過先前的化療暴露，與無先前化療暴露的患者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[27]。當(dāng)然，即使從完全緩解的患者身上取出用于凍存的卵巢，也不能完全排除攜癌細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)[9, 28]。未來如能有不需要卵巢組織移植而能利用凍存卵巢組織的技術(shù)，如始基卵泡的體外成熟[29]以及可移植的人工卵巢[30]，可明顯提高卵巢攜癌風(fēng)險(xiǎn)高的患者的生育力保護(hù)。

從凍存的卵巢組織中分離無白血病細(xì)胞的未成熟卵泡被認(rèn)為是可行的。然而，始基卵泡的體外成熟或者它們?cè)谌嗽炻殉仓械囊浦材壳斑€未用于人類，也不能作為自體移植的替代[13]。當(dāng)白血病幸存者考慮卵巢組織移植時(shí)，詳盡的組織評(píng)估對(duì)于提高移植安全性是必要的[26]。而且，患者需知曉目前檢測(cè)技術(shù)的局限以及個(gè)體權(quán)衡想要生物學(xué)后代的愿望與疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[25]。

3 避免惡性細(xì)胞再移回體內(nèi)的新策略

全球研究團(tuán)隊(duì)一直致力于開發(fā)兩種可安全恢復(fù)無法進(jìn)行卵巢組織移植患者的生殖功能的技術(shù)：(1)分離的竇前卵泡以可移植人工卵巢的形式移植回體內(nèi)生長[30]；(2)分離卵泡的體外生長[29]?；旧?，這兩種技術(shù)方法都是將竇前卵泡從卵巢組織中分離出來，然后在體內(nèi)或體外進(jìn)行卵泡發(fā)育。

3.1 可移植的人工卵巢

人工卵巢是天然卵巢的臨時(shí)替代物，分離的卵泡和卵巢基質(zhì)細(xì)胞包裹在生物材料中。主要目標(biāo)是安全的移植卵巢卵泡，確保性激素的分泌和可受精的成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育。為了設(shè)計(jì)人工卵巢，最重要的是卵泡。因此，在患者開始癌癥治療之前對(duì)卵巢組織進(jìn)行取材，可進(jìn)行卵巢組織凍存，也可以用來分離可凍存的竇前卵泡。無論何種卵泡分離方法，均需要鑒定細(xì)胞懸液中有無惡性細(xì)胞[31-32]。為此，Soares等[33]設(shè)計(jì)了一種采用重復(fù)洗滌過程來清除惡性細(xì)胞的特定方案。人工卵巢的第二個(gè)組成部分是卵巢細(xì)胞，當(dāng)患者痊愈時(shí)，新鮮的間質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞可以從癌癥治療后的第二次卵巢取材中收集[34]。也可以分離凍存卵巢組織中的卵巢細(xì)胞，但采集新鮮卵巢組織中的卵巢細(xì)胞可避免將惡性細(xì)胞添加到人造卵巢基質(zhì)中，而且凍存后的卵巢細(xì)胞可能沒有新鮮卵巢組織中的卵巢細(xì)胞有活力，雖然化療會(huì)損傷卵母細(xì)胞的存活和發(fā)育，但似乎對(duì)卵巢細(xì)胞沒有負(fù)面影響[15]。卵泡和卵巢細(xì)胞將被包裹在一個(gè)基質(zhì)中，基質(zhì)主要是為了給卵泡提供結(jié)構(gòu)性支持，且便于處理和移植。因此，這3個(gè)部分將組成人工卵巢，在癌癥治愈后可移植回患者體內(nèi)。

生理上，卵巢中所有卵泡周圍有一層特殊的細(xì)胞外基質(zhì)，即基底膜。在成人的卵巢卵泡中，基底膜主要由IV型膠原、層粘連蛋白以及少量的纖維連接蛋白和蛋白多糖組成[35]，在卵泡發(fā)育過程中其組成和厚度也在變化[36]?；啄さ拇嬖诳煞乐孤雅荼粣盒约?xì)胞污染。從卵巢組織中應(yīng)盡可能多的分離出完整卵泡，人原始卵泡和初級(jí)卵泡主要分布在卵巢皮質(zhì)中，其非常致密，富含膠原，安全有效地卵泡分離程序現(xiàn)在對(duì)人類應(yīng)用是可行的，為了獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的卵泡，最有效的方法通常依賴于機(jī)械和酶組織消化的組合[37]。分離過程中注意保持卵泡基底膜的完整性，可以通過顯微鏡監(jiān)測(cè)。Chiti等[38]優(yōu)化卵泡分離方案，將卵巢組織消化分成3個(gè)時(shí)間段(30、60和90 min)，采用的方法為機(jī)械法和酶消化法(Liberase DH和DNase I)，并引入過濾以取出已分離的卵泡，然后進(jìn)一步分離未消化的組織片段，總體上獲得了更高的卵泡產(chǎn)量，移植一周后卵泡恢復(fù)率(35%)高于之前的研究(20%)[39]。

早期卵泡發(fā)育受卵巢自分泌/旁分泌調(diào)節(jié)因子的控制，并且已知基質(zhì)細(xì)胞釋放各種正向調(diào)節(jié)原始卵泡向初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)變的因子。在原始卵泡被激活后，初級(jí)卵泡分泌其他因子來招募基質(zhì)細(xì)胞分化為功能性膜細(xì)胞，這些細(xì)胞參與卵泡的生長，并為顆粒細(xì)胞合成雌激素提供類固醇合成前體。因此，將卵巢基質(zhì)細(xì)胞添加到人工卵巢中可以重建卵泡和周圍基質(zhì)細(xì)胞之間的交互作用，潛在地促進(jìn)卵泡發(fā)育。血管化也是卵泡存活和生長的關(guān)鍵，因此移植后血管發(fā)育是必需的[40]。內(nèi)皮細(xì)胞可通過增強(qiáng)移植后的血運(yùn)重建來促進(jìn)細(xì)胞存活，分離的內(nèi)皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞共移植可促進(jìn)移植組織的血管化[41]?？傊?，分離的卵巢細(xì)胞具有體內(nèi)增殖、降解支架和合成新的細(xì)胞外基質(zhì)的潛能，使其能夠在人工卵巢中為分離的卵泡提供結(jié)構(gòu)支持。

人工卵巢的支架在植入后應(yīng)該具有生物相容性和可降解性，以便卵泡能夠發(fā)育、遷移、增殖和血管生成[42]。此外，支架材料必須符合生物安全和臨床兼容標(biāo)準(zhǔn)。從廣泛的生物材料中開發(fā)合適的支架來包裹卵泡并支持其發(fā)育仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。在卵泡發(fā)育過程中，卵泡從原始卵泡(0.03 mm)到成熟卵泡(18～24 mm)呈指數(shù)級(jí)增長，需要大量的卵巢細(xì)胞和血管來支持卵泡發(fā)育。天然的支架材料包括海藻酸鈉、膠原、纖維蛋白、血漿凝塊以及脫細(xì)胞卵巢細(xì)胞外基質(zhì)，合成的材料如聚乙二醇[30]。合成聚合物允許為臨床應(yīng)用量身定做機(jī)械性能，但它們不包含細(xì)胞黏附所需的分子，盡管可以添加生物活性因子來刺激細(xì)胞黏附。相反，天然聚合物含有生物功能分子，顯示出與細(xì)胞良好的相互作用，在細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化過程中起重要作用[43]。

一種采用小鼠原始卵泡制作的新型3D打印人工卵巢已被證明可用在小鼠身上并成功分娩健康幼崽[44]。目前需要進(jìn)一步的研究將技術(shù)應(yīng)用于制造人類的人工卵巢并將其應(yīng)用于臨床實(shí)踐。為了更好地應(yīng)用人工卵巢，需要更深入地了解冷凍保存后卵巢的力學(xué)、生物化學(xué)特性和卵泡發(fā)生，更好的體內(nèi)成像技術(shù)來觀察移植支架的血管化和降解，才能有效地進(jìn)行臨床應(yīng)用[43]。

3.2 體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)始基卵泡是另一項(xiàng)新技術(shù)，也避免了自體移植攜癌風(fēng)險(xiǎn)高的卵巢組織。凍存的卵巢組織中主要含有原始卵泡，但也提供了從小的竇卵泡中獲得未成熟卵母細(xì)胞的可能。因此，在不適合移植的情況下，通過從生長中的卵泡中提取卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟(in vitro maturation, IVM)，或者通過原始卵泡的完全體外生長(in vitro growth, IVG)和成熟(IVGM)為第二次減數(shù)分裂中期(MII)卵母細(xì)胞，可以在體外安全地恢復(fù)生育力。IVM和IVG方法的發(fā)展可以支持卵巢組織中所有階段的卵母細(xì)胞，將最大限度地發(fā)揮所有接受生育力保護(hù)的患者的潛力[45]。但這一領(lǐng)域的進(jìn)展是謹(jǐn)慎的，要找到最佳的培養(yǎng)基和條件來促進(jìn)人始基卵泡的高效體外培養(yǎng)是一項(xiàng)艱巨的工作。

IVG和IVGM以及隨后體外受精(in vitro fertilization, IVF)已成功應(yīng)用在小鼠上并成功分娩其后代[46]。成功的小鼠卵母細(xì)胞/卵泡IVG系統(tǒng)的開發(fā)突出了對(duì)支持人類卵泡IVG的多步培養(yǎng)系統(tǒng)的需求。卵泡發(fā)育的每個(gè)階段，從原始卵泡激活生長到成熟，都需要不斷變化的條件，因此需要一個(gè)動(dòng)態(tài)的培養(yǎng)系統(tǒng)來支持3個(gè)主要的過渡步驟：①始基卵泡的激活；②生長卵泡的分離和培養(yǎng)，以實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞的生長和發(fā)育；③卵泡環(huán)境的去除和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的成熟。IVM已成功應(yīng)用于人類卵母細(xì)胞，并取得了不同程度的進(jìn)展[47-48]。任何IVG系統(tǒng)的終點(diǎn)都是產(chǎn)生具有發(fā)育能力和表觀遺傳學(xué)正常的卵母細(xì)胞；因此，未來的研究需要集中于優(yōu)化每個(gè)階段，并進(jìn)一步了解IVG卵母細(xì)胞和任何形成的胚胎的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)。McLaughlin等[49]已經(jīng)成功地使人類始基卵泡生長和成熟到竇前、竇卵泡和MII期，提供了證明人類卵母細(xì)胞的完全發(fā)育可以在體外發(fā)生的概念。IVG卵母細(xì)胞的形態(tài)評(píng)價(jià)和受精潛力需要進(jìn)一步優(yōu)化，以確定其是否正常。不同年齡和青春期成熟階段的卵泡數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，青春期前女孩的卵泡在體外表現(xiàn)出與成人不同的生長軌跡[50]，為成人組織開發(fā)的培養(yǎng)系統(tǒng)可能不適合青春期前女孩，需要針對(duì)特定年齡段調(diào)整和完善培養(yǎng)體系。因此，體外培養(yǎng)在臨床應(yīng)用之前還需要做更多的工作。

4 小結(jié)與展望

現(xiàn)在有足夠的證據(jù)支持卵巢組織凍存和移植以恢復(fù)生育力的可行性和有效性。然而，一些擔(dān)憂仍然阻礙了卵巢組織移植在所有患者中的應(yīng)用。在一些癌癥中，存在將惡性細(xì)胞與卵巢組織一起重新移植入體內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。近年來，研究人員已經(jīng)制定了許多策略來解決這些問題?？梢浦踩斯ぢ殉驳某晒υ诤艽蟪潭壬先Q于對(duì)卵泡發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制的理解，以及卵泡與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用以維持和發(fā)育合適的卵泡。因此，找到最合適的支架來容納分離的卵泡是至關(guān)重要的。另一個(gè)關(guān)鍵問題是在臨床應(yīng)用之前，確定分離和移植對(duì)人類卵泡是否有表觀遺傳學(xué)影響。人工卵巢還有其他重要用途，例如，可以輔助對(duì)卵泡發(fā)育的理解，以及在毒性學(xué)研究中的應(yīng)用可解釋不同藥物對(duì)生殖的影響。它還可以為研究卵原干細(xì)胞和評(píng)估它們重新啟動(dòng)人類配子發(fā)生的能力提供一個(gè)合適的環(huán)境。人工卵巢的發(fā)展將是生殖組織工程領(lǐng)域的革命性一步。

如果可靠的方法能夠體外產(chǎn)生可受精的成熟的人卵母細(xì)胞，這將是一個(gè)可行的替代自體卵巢組織移植的方法。除了各種IVG系統(tǒng)的臨床意義和潛力外，它們中的每一個(gè)系統(tǒng)都提供了進(jìn)入人類卵子發(fā)生過程的實(shí)驗(yàn)上容易處理的輔助樣本。通過這些系統(tǒng)，我們將更好地了解人類卵母細(xì)胞的發(fā)育，最終改善生育力的保存。