梭魚草化感物質(zhì)丁二酸、肉桂酸及香草酸對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)

趙 楚，錢燕萍,2，田如男

（1.南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京曉莊學(xué)院 環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210000）

水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致水華頻繁爆發(fā)，影響水體景觀，引起水質(zhì)惡化，最為常見的藍(lán)藻水華還會(huì)產(chǎn)生多種天然毒素。傳統(tǒng)的物理控藻、化學(xué)控藻方式存在成本高昂、易造成二次污染等問題[1?3]，利用水生植物改善治理水體問題成為當(dāng)前研究的主要方向。20世紀(jì)70年代，RICE[4]提出了化感作用的概念，即植物或微生物通過釋放化學(xué)物質(zhì)到周邊環(huán)境中而產(chǎn)生的對(duì)其他植物或者微生物直接或間接的有害作用。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物釋放的常見化感抑藻物質(zhì)進(jìn)行了大量研究，其中酚酸與脂肪酸是最常見的2種類型[5]，如NAKAI等[6]從狐尾藻Myriophyllumspicatum中分離鑒定出鞣花酸、沒食子酸、鄰苯二酚酸、(+)-兒茶素4種酚酸，其聯(lián)合作用對(duì)銅綠微囊藻Microcystisaeruginosa產(chǎn)生協(xié)同生長(zhǎng)抑制；陳國(guó)元等[7]從黃菖蒲Irispseudacorus中提取有機(jī)酸組分對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制顯著，鑒定出15種脂肪酸類物質(zhì)和9種酚酸類物質(zhì)；高云霓等[8]證實(shí)苦草Vallisneriaspiralis種植水中的酚酸組分對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)具有抑制作用，進(jìn)一步鑒定出阿魏酸等9種酚酸類物質(zhì)，并提出不同種類酚酸的聯(lián)合作用可能是水生植物抑藻的重要機(jī)制。梭魚草Pontederiacordata是園林中廣泛應(yīng)用的水生觀賞植物，不僅能去除污染水體中的總氮、總磷[9]，還可以有效抑制有害藻類生長(zhǎng)[10]，在凈化污水、防止水華等方面表現(xiàn)出很好的應(yīng)用潛力。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，梭魚草根狀莖水浸提液對(duì)銅綠微囊藻抑制效果最佳，并從中提取鑒定出多種有機(jī)酸類物質(zhì)，篩選出梭魚草根狀莖中含量較高、抑藻效果較好的丁二酸、肉桂酸、香草酸[11]。因此本研究對(duì)這3種化感物質(zhì)單一及聯(lián)合作用對(duì)藍(lán)藻主要藻種——銅綠微囊藻的抑制效果進(jìn)行研究，以期探究梭魚草根狀莖有機(jī)酸類化感物質(zhì)對(duì)藍(lán)藻的抑制機(jī)理，為推廣梭魚草在凈化水體方面的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

銅綠微囊藻屬于藍(lán)藻門Cyanophyta色球藻科Chroococcaceae微囊藻屬M(fèi)icrocystis，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，編號(hào)為FACHB-315。銅綠微囊藻培養(yǎng)于BG-11培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度(25±1) ℃、光暗比12 h/12 h，光照強(qiáng)度2 500 lx，定時(shí)震蕩3次·d?1，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

在梭魚草根狀莖中分離鑒定出11種有機(jī)酸類化感物質(zhì)，選擇抑藻效果較強(qiáng)的丁二酸、肉桂酸、香草酸，采用其標(biāo)準(zhǔn)品模擬進(jìn)行抑藻實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)品純度≥99.5%。上述化學(xué)試劑與二甲亞砜均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單一有機(jī)酸化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用 依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，丁二酸、肉桂酸的質(zhì)量濃度梯度分別設(shè)置為0 (對(duì)照)、20、40、50、60、80、100 mg·L?1，香草酸的質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0 (對(duì)照)、20、40、60、80、100、120 和 150 mg·L?1，吸取上述物質(zhì)各 100 μL 分別添加至 100 mL 銅綠微囊藻藻液中[D(650)=0.15]。所有處理均重復(fù)3次。每24 h采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定藻細(xì)胞D(650)，計(jì)算抑藻率。

1.2.2 有機(jī)酸化感物質(zhì)聯(lián)合對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用 根據(jù)前期研究結(jié)果[11]，將丁二酸和肉桂酸以1∶1的質(zhì)量濃度比例二維混合，丁二酸和香草酸、肉桂酸和香草酸均以1∶2的質(zhì)量濃度比例二維混合，丁二酸、肉桂酸和香草酸以1∶1∶2的質(zhì)量濃度比例三維混合。設(shè)置混合后的質(zhì)量濃度梯度為0 (對(duì)照)、20、40、60、80、100 mg·L?1，吸取上述物質(zhì)各100 μL分別添加至100 mL銅綠微囊藻藻液中[D(650)=0.15]。所有處理均重復(fù)3次。每24 h測(cè)定藻細(xì)胞D(650)，計(jì)算抑藻率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 抑藻率計(jì)算 各處理對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算公式為：IR=(1?N/M)×100%。其中：IR為抑制率；N為第t天處理組的藻細(xì)胞D(650)；M為第t天對(duì)照組的藻細(xì)胞D(650)；IR為正值表示抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)，負(fù)值表示促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)。采用Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。在方差分析顯著的基礎(chǔ)上，用Duncan法進(jìn)行比較檢驗(yàn)。

1.3.2 半抑制質(zhì)量濃度(CE50)計(jì)算方法 采用SPSS 19.0軟件，通過概率單位法(Probit過程)計(jì)算各個(gè)化感物質(zhì)聯(lián)合作用于藻類72 h的CE50[12]。

1.3.3 聯(lián)合作用評(píng)價(jià)方法 采用毒性單位法[13]和相加指數(shù)法[14]對(duì)有機(jī)酸類化感物質(zhì)抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)的效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。①毒性單位法(UT)。規(guī)定混合物中第i組分的毒性單位為：UTi=Ci/CL50,i。其中：Ci為混合物中i組分的質(zhì)量濃度，CL50,i為i組分單獨(dú)作用時(shí)的半致死質(zhì)量濃度。M與M0為評(píng)價(jià)毒性效應(yīng)的相加指數(shù)，對(duì)于一個(gè)N組分的混合物來說，混合物的毒性單位UTmix等于各組分毒性單位之和(M)，即：。若令，M0=M/(UTi)max，則當(dāng)M=1時(shí)，為相加作用；當(dāng)M＞M0時(shí)，為拮抗作用；當(dāng)M＜1時(shí)，為協(xié)同作用；當(dāng)M=M0時(shí)，為無(wú)相加或獨(dú)立作用；當(dāng)M0＞M＞1時(shí)，為部分相加作用，其中(UTi)max表示混合物中各組分毒性單位的最大值。②相加指數(shù)法(AI)。相加指數(shù)法(AI)是在毒性單位概念的基礎(chǔ)上提出的，定義如下：當(dāng)M=1時(shí)，IA=M?1；當(dāng)M＜1時(shí)，IA=1/M?1；當(dāng)M＞1時(shí)，IA=1?M。其中，IA為相加指數(shù)。IA的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：當(dāng)IA=0時(shí)，為簡(jiǎn)單的相加作用；當(dāng)IA＜0時(shí)，為拮抗作用；當(dāng)IA＞0時(shí)，為協(xié)同作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一有機(jī)酸化感物質(zhì)處理對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

通過方差分析和多重對(duì)比(圖1)可知：處理質(zhì)量濃度與處理時(shí)間對(duì)3種化感物質(zhì)抑藻效果均有顯著影響(P＜0.05)。丁二酸、肉桂酸、香草酸單一作用于銅綠微囊藻時(shí)，初期均呈現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，香草酸尤為顯著。處理第1天時(shí)，低質(zhì)量濃度(≤60 mg·L?1)丁二酸、肉桂酸及香草酸處理均能夠在不同程度上促進(jìn)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。不同質(zhì)量濃度肉桂酸、丁二酸、香草酸對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)均具有顯著差異(P＜0.05)，隨著質(zhì)量濃度升高，抑藻能力逐漸增強(qiáng)。香草酸低質(zhì)量濃度處理對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)幾乎沒有抑制作用，肉桂酸低質(zhì)量濃度處理抑藻效果最佳，20 mg·L?1處理7 d時(shí)抑藻率達(dá)77.86%。3種有機(jī)酸處理隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑藻作用整體先上升后穩(wěn)定。60、80 mg·L?1的香草酸處理以及20、40 mg·L?1的丁二酸處理的抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，肉桂酸所有處理抑藻率均隨時(shí)間上升，處理7 d時(shí)各質(zhì)量濃度抑藻率最大差值僅為7.56%。處理第7天，丁二酸、肉桂酸質(zhì)量濃度為100 mg·L?1、香草酸質(zhì)量濃度為150 mg·L?1時(shí)抑藻率達(dá)到最高，分別為87.42%、85.42%和86.95%。

2.2 有機(jī)酸化感物質(zhì)聯(lián)合處理對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響

由圖2可見：當(dāng)丁二酸、肉桂酸和香草酸以二維方式聯(lián)合作用于銅綠微囊藻時(shí)，各處理組抑藻效果隨著處理質(zhì)量濃度的升高及處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，差異達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。丁二酸+肉桂酸不同質(zhì)量濃度處理均具有抑藻效果，而低質(zhì)量濃度丁二酸+香草酸與肉桂酸+香草酸處理在實(shí)驗(yàn)前期具有促進(jìn)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的作用，20 mg·L?1處理中肉桂酸+香草酸第5天抑藻率最高，為20.73%。丁二酸+香草酸處理實(shí)驗(yàn)期間各質(zhì)量濃度抑藻率始終差異顯著(P＜0.01)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，丁二酸+香草酸與丁二酸+肉桂酸抑藻率呈先上升后穩(wěn)定的趨勢(shì)，肉桂酸+香草酸呈先上升后下降的趨勢(shì)。處理第7天，丁二酸+肉桂酸、丁二酸+香草酸質(zhì)量濃度為100 mg·L?1時(shí)，其抑藻率最高，分別為92.78%、84.81%；處理第6天，肉桂酸+香草酸質(zhì)量濃度為100 mg·L?1，其抑藻率最高，為77.94%。

當(dāng)3種有機(jī)酸以三維方式聯(lián)合作用于銅綠微囊藻時(shí)，處理質(zhì)量濃度和處理時(shí)間對(duì)抑藻率的影響差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。20 mg·L?1的處理僅在第1天對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)具有抑制效果，其他質(zhì)量濃度處理均具有明顯的抑藻效果，40 mg·L?1處理在第 2天抑制率達(dá) 46.37%，為最大，60、80 mg·L?1處理在第3天抑制率最大，為53.45%和61.76%，處理第7天，處理質(zhì)量濃度為100 mg·L?1時(shí)，其抑藻率最高，為89.99%。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，40、60、80 mg·L?1處理抑制效果先上升后下降，100 mg·L?1處理抑藻率上升且 2～4、6～7 d 差異不顯著。

圖 1 肉桂酸(A)、丁二酸(B)、香草酸(C)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響Figure 1 Effects of cinnamic acid (A), succinic acid (B), vanillic acid (C) on the growth of M.aeruginosa

2.3 有機(jī)酸化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻毒性效應(yīng)的評(píng)價(jià)

經(jīng)肉桂酸、丁二酸和香草酸分別處理72 h時(shí)，對(duì)銅綠微囊藻的半致死質(zhì)量濃度分別為52.95、54.32和106.00 mg·L?1，此時(shí)這3種有機(jī)酸類化感物質(zhì)抑藻能力大小為肉桂酸＞丁二酸＞香草酸。丁二酸+肉桂酸、丁二酸+香草酸、肉桂酸+香草酸、丁二酸+肉桂酸+香草酸處理在實(shí)驗(yàn)第72小時(shí)的半致死質(zhì)量濃度分別為51.03、78.69、52.84和59.04 mg·L?1，此時(shí)這3種有機(jī)酸類化感物質(zhì)聯(lián)合作用的抑藻能力大小依次為丁二酸+肉桂酸＞肉桂酸+香草酸＞丁二酸+肉桂酸+香草酸＞丁二酸+香草酸。此外，由表1和表2可知：采用毒性單位法和相加指數(shù)法對(duì)銅綠微囊藻聯(lián)合作用的評(píng)價(jià)結(jié)果均是協(xié)同作用。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)：利用丁二酸、肉桂酸、香草酸單獨(dú)作用于銅綠微囊藻初期均會(huì)導(dǎo)致抑制率出現(xiàn)“低促高抑”的現(xiàn)象，劉曉宇等[15]、YAN等[16]研究中也觀察到了相似的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)榈唾|(zhì)量濃度的丁二酸、肉桂酸、香草酸可以一定程度上改變?cè)寮?xì)胞膜透性，使細(xì)胞更易從外界獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[17]。然而，較高質(zhì)量濃度有機(jī)酸則會(huì)明顯抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)，研究期間觀察到的藻液顏色逐漸變淡可以證明，可能是較高質(zhì)量濃度有機(jī)酸超過了藻細(xì)胞膜的承受閾值，導(dǎo)致藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)溶物大量外滲[18]。

圖 2 有機(jī)酸化感物質(zhì)聯(lián)合處理對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響Figure 2 Effects of combined succinic acid, cinnamic acid and vanillic acid on the growth of M.aeruginosa

表 1 利用毒性單位法評(píng)價(jià)有機(jī)酸聯(lián)合對(duì)銅綠微囊藻的毒性效應(yīng)Table 1 Results of toxic unit on the joint effects of the mixture of organic acids on M.aeruginosa

表 2 利用相加指數(shù)法評(píng)價(jià)有機(jī)酸聯(lián)合對(duì)銅綠微囊藻的毒性效應(yīng)Table 2 Results of additive index on the joint effects of the mixture of organic acids on M.aeruginosa

為獲得在生存環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，植物往往向環(huán)境中分泌多種化感物質(zhì)。陳國(guó)元等[7]研究發(fā)現(xiàn)：黃菖蒲水浸提液中含有丁酸、辛酸、戊酸等，均被證實(shí)具有較強(qiáng)抑藻能力。NAKAI等[19?20]從穗花狐尾藻中提取的鞣花酸、沒食子酸兒茶酚均能抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)。INDERJIT等[21]認(rèn)為，幾乎所有的化感作用都是多種化感物質(zhì)聯(lián)合作用的結(jié)果，這種聯(lián)合作用可以強(qiáng)化化感作用效果。同時(shí)，結(jié)構(gòu)類似的同類化感物質(zhì)聯(lián)合作用抑藻存在協(xié)同或相加效應(yīng)[22?23]。本研究中，丁二酸屬于脂肪酸類，肉桂酸與香草酸為酚酸類，3種化感物質(zhì)以二維、三維方式聯(lián)合對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制作用均表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，與倪利曉等[12]在酚酸與不飽和脂肪酸聯(lián)合作用對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)影響上的研究結(jié)果類似，表明脂肪酸與酚酸化感物質(zhì)聯(lián)合處理能夠有效增強(qiáng)其對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果。本研究證實(shí)3種化感物質(zhì)單一及聯(lián)合作用抑藻能力從高到低依次為丁二酸+肉桂酸、肉桂酸+香草酸、肉桂酸、丁二酸、丁二酸+肉桂酸+香草酸、丁二酸+香草酸、香草酸。肉桂酸、丁二酸單一作用時(shí)抑藻效果最好，二者聯(lián)合作用抑藻能力最強(qiáng)。肉桂酸抑藻效果強(qiáng)于丁二酸，二者分別與香草酸聯(lián)合時(shí)，肉桂酸+香草酸的抑藻效果更佳。由此說明單一作用時(shí)抑藻效果較好的化感物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)合作用時(shí)抑藻效果也相對(duì)較好。丁二酸+肉桂酸+香草酸抑藻效果明顯弱于丁二酸、肉桂酸單一及聯(lián)合作用單一作用時(shí)抑藻效果，可能是香草酸抑藻能力最差，在聯(lián)合作用時(shí)會(huì)削弱整體的抑藻效果。這與GAO等[23]的研究結(jié)果相一致，表明抑藻活性較差的化感物質(zhì)會(huì)削弱梭魚草根狀莖有機(jī)酸化感物質(zhì)聯(lián)合抑藻效果。丁二酸、肉桂酸單一作用時(shí)抑藻能力相當(dāng)，但二者分別與香草酸聯(lián)合作用時(shí)，表現(xiàn)為肉桂酸+香草酸的抑藻效果遠(yuǎn)低于丁二酸+香草酸，這可能是因?yàn)橥N類的化感物質(zhì)聯(lián)合抑藻效果更佳。

半抑制質(zhì)量濃度表示一定時(shí)間銅綠微囊藻被半數(shù)抑制的毒物質(zhì)量濃度。高云霓等[8]發(fā)現(xiàn)：香草酸處理72 h對(duì)銅綠微囊藻的EC50約60 mg·L?1；張庭廷等[24]發(fā)現(xiàn)：肉桂酸處理6 d對(duì)銅綠微囊藻與蛋白核小球Chlorellapyrenoidosa混合體系的半抑制質(zhì)量濃度為89.34 mg·L?1，與本研究結(jié)果存在明顯的差異，這可能與植物種類、藻類初始質(zhì)量濃度、處理時(shí)間等因素有關(guān)。同時(shí)，梭魚草根狀莖分泌的丁二酸、肉桂酸、香草酸含量明顯低于其對(duì)銅綠微囊藻的半抑制質(zhì)量濃度，這與NAKAI等[6]的結(jié)論相一致。即便水體中可檢測(cè)到的化感物質(zhì)很低，但其控藻效果極佳，這可能與植物化感作用方式有關(guān)。低劑量持續(xù)作用可能是水生植物抑藻作用的重要機(jī)理[25]。除此之外，通過不同聯(lián)合作用，在降低單個(gè)物質(zhì)作用劑量以達(dá)到更好的抑藻效果可能是植物化感抑藻作用的重要機(jī)制[12]。但是，多種化感物質(zhì)共同作用于藻類時(shí)，其作用機(jī)理比單一種類化感物質(zhì)更為復(fù)雜[26]。這也是自然條件下植物釋放化感物質(zhì)作用于藻類的方式，化感物質(zhì)的種類、質(zhì)量濃度及環(huán)境條件等均會(huì)影響聯(lián)合作用效果，因此聯(lián)合處理對(duì)藻生長(zhǎng)的作用機(jī)制值得進(jìn)一步探究。同時(shí)，3種化感物質(zhì)的抑藻效果顯著，具有開發(fā)為抑藻劑的潛質(zhì)，但其作為抑藻制劑的生態(tài)安全性也有待深入研究。

除此之外，一些研究表明自然界中梭魚草化感物質(zhì)含量雖然遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)室所得半抑制質(zhì)量濃度，但仍然能有效抑制藻類。張景雯等[9]研究發(fā)現(xiàn)：共培養(yǎng)條件下梭魚草植株在試驗(yàn)期間對(duì)重度污染水的銅綠微囊藻平均抑制率超過70%。田如男等[11]通過共培養(yǎng)以及種植水處理的方式，證實(shí)梭魚草均能有效控制銅綠微囊藻、斜生柵藻Scenedesmusobliqnus和小球藻Chlorellavulgaris的生長(zhǎng)。表明梭魚草具有控制水華的能力，存在開發(fā)為凈化水體植物的潛力，所以有關(guān)梭魚草在自然水體中的控藻方式及應(yīng)用方法值得進(jìn)一步探索。