中藥有效成分直接作用靶點(diǎn)的鑒定方法及應(yīng)用＊

李瑞梅，程 瑤，朱 朱，陳飛燕，戴建國(guó)，陳 琳，趙玉男

（南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院/整合醫(yī)學(xué)學(xué)院 南京 210023）

在藥物療效的證實(shí)或證偽中，“藥效-機(jī)制-靶點(diǎn)”可看做是一條“證據(jù)鏈”，其中靶點(diǎn)是重中之重[1]。目前，對(duì)中藥藥效和作用機(jī)制的研究相對(duì)比較成熟，但是對(duì)其靶點(diǎn)的探索尚處于起步階段。醫(yī)藥界對(duì)于闡釋藥物的靶點(diǎn)有迫切需求，中藥靶點(diǎn)的鑒定對(duì)其在臨床的應(yīng)用和現(xiàn)代中藥的開發(fā)均具有重要的意義[2]。

目前，探索天然產(chǎn)物靶點(diǎn)的方法主要包括標(biāo)記法和非標(biāo)記法：標(biāo)記法首先需標(biāo)記待研究的天然產(chǎn)物，進(jìn)而闡明它們?cè)诘鞍踪|(zhì)組中的結(jié)合物，例如親和垂釣技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)；由于標(biāo)記天然產(chǎn)物費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且小分子結(jié)構(gòu)的改變也可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合，產(chǎn)生假陽性結(jié)果[3]，因而非標(biāo)記法應(yīng)運(yùn)而生，例如：Drug Affinity Responsive Target Stability（DARTS）、Cellular Thermal Shift Assay（CETSA）、Stability of Proteins from Rates of Oxidation（SPROX）等技術(shù)。此外，還有一些基于基因組學(xué)和生物信息學(xué)的方法，預(yù)測(cè)小分子體內(nèi)的作用靶點(diǎn)。運(yùn)用這些新方法鑒定天然產(chǎn)物靶蛋白的同時(shí)，還應(yīng)進(jìn)行靶蛋白的確定及隨后的效應(yīng)分析，從而構(gòu)建“藥效-機(jī)制-靶點(diǎn)”證據(jù)鏈。

1 基于標(biāo)記法對(duì)分子靶點(diǎn)的探索

1.1 親和垂釣技術(shù)

該方法利用生物分子之間的親和力原理，將小分子制成固相吸附劑并放置在層析柱中，將蛋白混合液倒入層析柱時(shí)，與吸附劑具有親和力的蛋白質(zhì)被吸附在層析柱中，而其余沒有親和力的蛋白質(zhì)不會(huì)停留，直接流出。隨后選用合適的洗脫液，改變結(jié)合條件，將具有親和力的蛋白質(zhì)洗脫下來進(jìn)行鑒定。

比如：劉傳緒等[4]將腺花香茶菜中的活性成分腺花素作為分子探針，垂釣出其潛在的靶蛋白過氧化還原酶Ⅰ/Ⅱ，發(fā)現(xiàn)腺花素通過特異性靶向過氧化還原酶Ⅰ/Ⅱ，誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞分化，進(jìn)而起到治療作用；Dong 等[5]運(yùn)用親和垂釣技術(shù)發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物Ainsliadimer A 可以選擇性地與IKKα/β蛋白上保守的46 位半胱氨酸殘基結(jié)合，進(jìn)而通過變構(gòu)效應(yīng)抑制其活性以阻斷NF-κB 信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)抗癌、抗炎作用；此外，親和垂釣技術(shù)還運(yùn)用于淫羊藿苷抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)研究、遠(yuǎn)志酯抗炎癥作用的靶點(diǎn)探索等[6]。

本課題組以人參皂苷作為配體，與固相載體偶聯(lián)制備親和樹脂，利用親和垂釣技術(shù)鑒定出肌肉型肌酸激酶（CK-MM）可能是人參皂苷在骨骼肌中的潛在作用靶點(diǎn)之一。隨后課題組以20(S)-原人參二醇（PPD）為代表通過生物膜層干涉技術(shù)、等溫滴定量熱法、分子對(duì)接等多種方法，驗(yàn)證了20(S)-PPD 與CK-MM 的特異性結(jié)合。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示，20(S)-PPD 與CK-MM 的結(jié)合能提高CK-MM 的酶活，進(jìn)而改善運(yùn)動(dòng)性能，從而發(fā)揮抗疲勞的藥效[7]；此外，本課題組還通過親和垂釣法結(jié)合SDS-PAGE 凝膠電泳、質(zhì)譜法和生物膜層干涉技術(shù)等，探究人參總皂苷在腦內(nèi)的潛在作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白是人參總皂苷腦內(nèi)的作用靶點(diǎn)之一，人參皂苷體內(nèi)代謝產(chǎn)物原人參二醇、原人參三醇可能是14-3-3蛋白的激活劑[8]。

親和垂釣是最早提出、也是最經(jīng)典的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)方法，廣泛應(yīng)用于目標(biāo)蛋白的鑒定，并取得了良好的效果。然而，這種方法也有局限性：固定化可能會(huì)導(dǎo)致天然產(chǎn)物活性的改變；相互結(jié)合處的空間結(jié)構(gòu)容易受到阻礙，因此難以找出與該空間結(jié)構(gòu)有親和力的蛋白質(zhì)。這些局限性導(dǎo)致利用此法鑒定小分子體內(nèi)的作用靶點(diǎn)存在一些不確定性。

1.2 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)最初由美國(guó)密蘇里大學(xué)的Smith等人于1985年建立，它是將外源基因片段克隆至噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在噬菌體的表面，被展示的多肽或蛋白質(zhì)可保持相對(duì)的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。該技術(shù)在抗原表位分析、分子間相互識(shí)別、新型疫苗及藥物的開發(fā)研究方面有廣泛的應(yīng)用前景[9]。

近年來，噬菌體展示技術(shù)被運(yùn)用于探索小分子藥物體內(nèi)的作用靶點(diǎn)[10,11]。該技術(shù)的篩選原理又稱“生物淘洗”。與親和垂釣原理相同，該法也是利用分子與配體之間的特異性親和力進(jìn)行的。首先，將待測(cè)的目標(biāo)分子通過共價(jià)鍵固定化在載體上，加入噬菌體文庫(kù)，令其進(jìn)行充分的相互作用并結(jié)合選擇，在此過程中，含有與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的噬菌體克隆將結(jié)合到載體上，未結(jié)合的噬菌體克隆直接被洗去。然后，使用緩沖液將已經(jīng)結(jié)合的噬菌體克隆洗脫下來，用于感染宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的噬菌體重復(fù)上述的篩選。經(jīng)過3-5 輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的循環(huán)式篩選，最終得到的噬菌體克隆經(jīng)初步結(jié)合試驗(yàn)鑒定后，分別選取單個(gè)克隆進(jìn)行基因序列分析，根據(jù)測(cè)序結(jié)果可得到其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，即為與目標(biāo)分子結(jié)合的靶蛋白序列。

噬菌體展示技術(shù)為小分子化合物靶蛋白的篩選與鑒定提供了有效的技術(shù)支持，許多研究者已將其運(yùn)用于中藥有效成分的研究中。Rodi等[12]運(yùn)用該技術(shù)對(duì)抗癌藥物紫杉醇進(jìn)行隨機(jī)篩選，結(jié)合ELISA 檢測(cè)證實(shí)了Bcl-2 蛋白是紫杉醇在體內(nèi)的作用靶點(diǎn)；Takakusagi等[13]利用該方法對(duì)噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)進(jìn)行篩選，得到了抗腫瘤藥物喜樹堿的靶點(diǎn)蛋白；潘超等[14]利用全細(xì)胞差減篩選法對(duì)噬菌體十二肽庫(kù)進(jìn)行了3 輪淘選，隨后進(jìn)行DNA 序列分析，在隨機(jī)挑選的32 個(gè)噬菌體克隆種，篩選到三水白虎湯作用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的靶點(diǎn)；Wang等[15]通過噬菌體展示實(shí)驗(yàn)結(jié)合CETSA和Isothermal titration calorimetry（ITC）分析，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2 直接與重組或細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A2結(jié)合，首次提出Rh2抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞靶點(diǎn)和分子途徑。

該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括：基因型與表現(xiàn)型的直接聯(lián)系，使得噬菌體文庫(kù)可以經(jīng)過簡(jiǎn)單易行的篩選后進(jìn)行操作；噬菌體展示文庫(kù)可提供大量的蛋白質(zhì)或多肽的結(jié)構(gòu)信息，實(shí)現(xiàn)了高通量和高效率篩選的可能性。不足之處在于小分子化合物的功能基團(tuán)與固相載體偶聯(lián)的同時(shí)，會(huì)使功能基團(tuán)周邊的空間結(jié)構(gòu)受到阻礙，因此與該空間結(jié)構(gòu)有親和力的噬菌體克隆不會(huì)被“淘洗”出來；而且，通過噬菌體展示技術(shù)得到的只是“可能”的靶蛋白，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2 基于非標(biāo)記法對(duì)分子靶點(diǎn)的探索

2.1 DARTS方案

DARTS 方案由加利福尼亞大學(xué)的Jing Huang 教授課題組于2009年在《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，PNAS）上首次提出[16]，2011年和2015年，該課題組對(duì)此方案進(jìn)行了更詳細(xì)的闡述[17]。該技術(shù)巧妙地利用了蛋白酶保護(hù)現(xiàn)象，其原理為小分子配體與蛋白質(zhì)結(jié)合后可增強(qiáng)該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，避免其被蛋白酶降解，即靶蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是通過其與相應(yīng)配體的結(jié)合而改變的。通過聯(lián)合使用液相色譜和質(zhì)譜法，檢測(cè)SDS-PAGE中的保護(hù)帶，實(shí)現(xiàn)靶蛋白的鑒定。

近年來，基于該技術(shù)探索天然小分子產(chǎn)物體內(nèi)作用靶點(diǎn)的報(bào)道不斷涌現(xiàn)。比如，Derry 等[18]對(duì)葡萄籽提取 物（Grape seed extract，GSE）在 人 結(jié) 直 腸 癌（Carcinoma of colon and rectum，CRC）細(xì)胞中的潛在蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行了研究，結(jié)合液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)MASCOT 蛋白鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白可能是GSE 細(xì)胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步機(jī)制研究證實(shí)，GSE 確實(shí)能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并強(qiáng)烈抑制PI3k-Akt-mTOR 通路對(duì)CRC 細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。陳瀟飛[19]探究四逆湯治療心肌梗死的靶標(biāo)蛋白，首先利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在正常組織和心梗組織中鑒定出590 個(gè)相關(guān)蛋白，與模型組相比四逆湯給藥組有81 個(gè)蛋白出現(xiàn)了顯著變化；進(jìn)而聯(lián)用DARTS方案與雙向熒光電泳技術(shù)篩選出11 個(gè)對(duì)四逆湯起作用的直接心肌靶標(biāo)，分析結(jié)果顯示，四逆湯治療心肌梗死的作用主要是通過影響琥珀酸合成反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。Dal Piza 等[20]人利用DARTS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)，laurifolioside（大戟屬植物Euphorbia laurifolia分離得到的天然產(chǎn)物之一）在PC-3和MCF-7 細(xì)胞中的直接作用靶點(diǎn)是內(nèi)涵素重鏈1；進(jìn)一步通過分子動(dòng)力學(xué)模擬與分子對(duì)接等技術(shù)，推測(cè)了laurifolioside 與內(nèi)涵素的結(jié)合構(gòu)象、氫鍵疏水鍵作用位點(diǎn)及結(jié)合能量。Yang 等[21]人聯(lián)合運(yùn)用DARTS 技術(shù)和免疫沉淀液色譜/質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)中藥材骨碎補(bǔ)的有效成分柚皮素及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物可通過與腦神經(jīng)元上的腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白-2 結(jié)合，促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)，改善阿爾茲海默癥的癥狀。

該方法的優(yōu)勢(shì)在于進(jìn)行目標(biāo)識(shí)別時(shí)不需要對(duì)小分子進(jìn)行任何的化學(xué)修飾，從而避免了繁瑣的有機(jī)合成和因化合物空間結(jié)構(gòu)改變帶來的生物活性丟失，可用于確定其直接結(jié)合的蛋白靶點(diǎn)。此外，由于實(shí)驗(yàn)步驟中不包括洗滌，DARTS 可用于分析低親和力物質(zhì)之間的相互作用[22,23]。但是，利用Western blotting 或考馬斯亮藍(lán)染色來闡明配體與靶蛋白的相互作用過程中，當(dāng)樣品中目標(biāo)蛋白豐度較低時(shí)，DARTS 法不易將目標(biāo)蛋白可視化。

2.2 CETSA方案

CETSA方案由瑞典卡羅林斯卡學(xué)院的Dr.Martinez Molina 于2013年在Science 上首次提出。2014年，他在Nat Protoc 雜志上發(fā)表了詳細(xì)的方案。CETSA 是研究細(xì)胞和組織中配體與蛋白質(zhì)結(jié)合的一種新的生物物理技術(shù)，該方案的原理為小分子配體與靶蛋白質(zhì)結(jié)合后可增加該蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，導(dǎo)致該蛋白的溶解溫度右移，即利用了配體誘導(dǎo)的靶蛋白的熱穩(wěn)定現(xiàn)象。將細(xì)胞或組織勻漿液與游離的小分子化合物直接孵育，然后進(jìn)行熱變性，變性的蛋白質(zhì)通過離心去除?；跓岱€(wěn)定的原理，靶蛋白可耐受熱變性而被保留在溶液中，隨后采用western 印跡法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。CETSA 與定量質(zhì)譜法結(jié)合使用可系統(tǒng)地研究藥物與細(xì)胞和組織樣本中靶蛋白的結(jié)合，有望成為驗(yàn)證和優(yōu)化藥物靶點(diǎn)參與的重要工具[24]。

利用該方法可以檢測(cè)配體與靶蛋白之間的相互作用，不需要任何額外的步驟即可利用完整細(xì)胞，是一種基于western blotting 和抗體對(duì)靶蛋白的高選擇性的方法。適用于多種類型的蛋白質(zhì)，但對(duì)于更大、更復(fù)雜的可溶性蛋白和膜蛋白的用途尚待確定。不過，該技術(shù)需要高濃度的藥物，在發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)的過程中明顯通量不足，常被用于靶點(diǎn)的驗(yàn)證和確定[25]。

比如：林兵[26]對(duì)豆豉姜中的活性成分LC36抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)進(jìn)行研究，首先通過大量文獻(xiàn)研究構(gòu)建了包含與該疾病有關(guān)的9 種蛋白質(zhì)的靶蛋白庫(kù)，然后將關(guān)鍵靶蛋白與活性成分進(jìn)行對(duì)接分析，做靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，最后通過CETSA 技術(shù)對(duì)預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)MEK1 和cathepsin 是LC36 抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用靶點(diǎn)。Vasaturo 等[27]聯(lián)合運(yùn)用CETSA 技術(shù)與經(jīng)典的生物化學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性藥物冬凌草甲素與核仁素蛋白有直接的相互作用，該發(fā)現(xiàn)是首次表明小分子物質(zhì)可結(jié)合核仁素蛋白并抑制其功能。陳香云[28]運(yùn)用CETSA 技術(shù)對(duì)新藤黃酸的抗骨肉瘤效應(yīng)進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)新藤黃酸通過靶向抑制USP9x（泛素特異性蛋白酶）的活性加速干細(xì)胞因子的降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，為靶向治療骨肉瘤提供新思路。CETSA技術(shù)還廣泛運(yùn)用于茯苓酸抗胃癌的靶點(diǎn)研究、兔耳風(fēng)天然產(chǎn)物Ainsliadimer A 的抗腫瘤靶點(diǎn)研究[29，30]等。

2.3 SPROX方案

SPROX 與DARTS 相似，是一種基于配體誘導(dǎo)靶蛋白穩(wěn)定性的靶點(diǎn)識(shí)別方法。不同的是，SPROX 并不檢測(cè)蛋白質(zhì)的水解模式，而是測(cè)量目標(biāo)蛋白的蛋氨酸氧化水平。其原理為當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)庫(kù)與小分子化合物一起孵育時(shí)，在化學(xué)變性劑鹽酸胍存在下，通過控制其濃度來調(diào)節(jié)蛋氨酸的氧化速率，最后對(duì)蛋氨酸的選擇性氧化速率進(jìn)行定量研究，繪制非氧化產(chǎn)物和氧化產(chǎn)物與鹽酸胍濃度的關(guān)系曲線，這兩條曲線的交點(diǎn)即為遷移中點(diǎn)（C1/2 值）。由于配體結(jié)合蛋白穩(wěn)定性增加，必須在相對(duì)高濃度的變性劑作用下才能得到相同濃度的氧化產(chǎn)物，所以具有比對(duì)照樣品更大的轉(zhuǎn)折中點(diǎn)。C1/2 值向較高變性劑濃度移動(dòng)即表示該蛋白的配體誘導(dǎo)了其穩(wěn)定，即可對(duì)比小分子探針與空白對(duì)照組的C1/2值來判斷蛋白是否為特異性結(jié)合靶蛋白。

該方法無需大量純化蛋白質(zhì)，并且可以進(jìn)行多重分析[31]。其不足之處在于，無法檢測(cè)不含蛋氨酸的蛋白質(zhì)與小分子的結(jié)合，同時(shí)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較低時(shí)由于其氧化反應(yīng)弱也不容易被檢測(cè)到。因此，與DARTS和CETSA 方法結(jié)合使用，相互補(bǔ)充，更有利于小分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。

目前利用SPROX 方法對(duì)中藥靶點(diǎn)的探究較少，DeArmond 等[32]利用該方法研究白藜蘆醇的蛋白質(zhì)靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)除了之前已知的靶點(diǎn)胞質(zhì)脫氫酶外，還有6個(gè)潛在的新蛋白靶點(diǎn)，其中四個(gè)與蛋白質(zhì)翻譯機(jī)制相關(guān)?？紤]到該方案的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率為2%-4%，研究者認(rèn)為這6個(gè)新發(fā)現(xiàn)的潛在靶標(biāo)仍需進(jìn)一步的確認(rèn)。

3 其它方法

由于藥物-靶點(diǎn)相互作用鑒定的實(shí)驗(yàn)方法仍然是極其昂貴、耗時(shí)并具有挑戰(zhàn)性的，因此除上述高通量直接篩選的方法外，還出現(xiàn)了大量間接識(shí)別天然產(chǎn)物靶點(diǎn)的方法。例如基于基因組學(xué)的RNA 干擾技術(shù)和CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)、基于生物信息學(xué)的Connectivity Map（CMAP）生物數(shù)據(jù) 庫(kù)和BATMANTCM在線分析工具等。

RNA 干擾技術(shù)利用shRNA 和siRNA 作為基因敲除工具，來驗(yàn)證小分子與靶蛋白的相互作用，同時(shí)對(duì)藥物靶點(diǎn)的篩選也具有一定作用[33-34]。該技術(shù)與高通量方法結(jié)合極大增加了基因組學(xué)的應(yīng)用范圍，成為了識(shí)別小分子靶點(diǎn)的有力工具。

與RNA 干擾技術(shù)相比，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)能有效克服脫靶[35]。運(yùn)用此技術(shù)對(duì)補(bǔ)骨脂活性成分補(bǔ)骨脂乙素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其通過抑制二氫乳清酸脫氫酶的活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)急性髓性白血病的細(xì)胞凋亡及分化的調(diào)節(jié)作用[36]。

生物信息學(xué)是計(jì)算機(jī)科學(xué)與信息處理相結(jié)合的一門綜合性、創(chuàng)新性的學(xué)科。CMAP 是基于基因表達(dá)圖譜的生物數(shù)據(jù)庫(kù)，通過獲取、對(duì)比并分析不同樣本小分子的基因表達(dá)圖譜，廣泛應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)與預(yù)測(cè)作用機(jī)制等方面[37-38]。2017年以CMAP 數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，建立了首個(gè)國(guó)內(nèi)關(guān)于天然產(chǎn)物小分子的基因表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，可用于預(yù)測(cè)靶點(diǎn)及小分子藥理學(xué)活性[39]。Chao等[40]聯(lián)用該數(shù)據(jù)庫(kù)與CMAP發(fā)現(xiàn)丹參提取物丹參酮IIA的抗腫瘤作用靶點(diǎn)是PKCζ和PKCε。

BATMAN-TCM 是首個(gè)結(jié)合中藥復(fù)方成分作用靶點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的工具，湯化琪等[41]利用其預(yù)測(cè)了玄胡索散對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療作用靶點(diǎn)。

4 小結(jié)與展望

中藥具有復(fù)雜的化學(xué)成分，并且配伍藥物較多，經(jīng)常是復(fù)方使用，藥物作用的特點(diǎn)是多靶點(diǎn)、多層次以及多環(huán)節(jié)。其有效成分的靶點(diǎn)鑒定是一個(gè)復(fù)雜且耗時(shí)的過程，需要多層次、多角度相互佐證。探究小分子與靶蛋白的相互作用不僅可以找到潛在的藥物作用靶標(biāo)，而且能夠?qū)λ幬锏臋C(jī)制和副作用有更深的了解。上述小分子靶點(diǎn)的探究方法都不能完全排除假陰性和假陽性的產(chǎn)生，而且在分離的過程中小分子的生物活性也會(huì)發(fā)生一定的改變，因此，闡述中藥有效成分的生物活性及相應(yīng)的靶標(biāo)常需多種方法聯(lián)合使用。相信隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，將有力推進(jìn)天然產(chǎn)物的研發(fā)并有助于對(duì)復(fù)雜中藥體系的現(xiàn)代化闡述。