手性功能化的整體柱在毛細(xì)管電色譜手性分離中的應(yīng)用研究進(jìn)展

張 柳 杜迎翔*

(1. 中國藥科大學(xué) 藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；2. 中國藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009)

毛細(xì)管電泳技術(shù)是1990年發(fā)展起來的集高效液相色譜(HPLC)和毛細(xì)管電泳(CE)特點(diǎn)于一體的雜交技術(shù)[1]。毛細(xì)管電色譜(CEC)結(jié)合了電驅(qū)動分離與多元手性固定相(CSP)的高分離選擇性的特點(diǎn)，色譜和電泳機(jī)制同時運(yùn)作。目前，毛細(xì)管柱主要分為三種：毛細(xì)管開管柱、毛細(xì)管填充柱和毛細(xì)管整體柱。

其中，整體柱是通過單步或多步共聚反應(yīng)制備的，具有可調(diào)節(jié)孔徑、高流體滲透率、低背壓、多種功能單體和表面化學(xué)性質(zhì)等特點(diǎn)[2，3]。眾所周知，對于任何手性分離，選擇最合適的CSP對于對映體分離是至關(guān)重要的。目前，不同類型的手性選擇劑已成功地應(yīng)用于不同類型化合物的手性分離。其中，以β-環(huán)糊精(β-CDs)、生物材料、多糖、奎寧和大環(huán)類抗生素為主。

1 環(huán)糊精(CDs)

CDs是一類重要的手性選擇劑(CS)，是由α-1, 4-糖苷鍵連接的吡喃葡萄糖單體組成的環(huán)狀寡糖，其中α-、β-和γ-CDs是三種天然存在的CDs，可用于多種分子的對映體拆分。β-CDs及其衍生物由于具有價廉、CDs-溶質(zhì)配合物可快速平衡、高效和可獲得較好的峰對稱性等優(yōu)點(diǎn)[4]，在CEC方面得到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用[5-11]。

由于納米顆粒(NP)較大的比表面積可以提高對映體的分離選擇性，CD修飾的金納米粒子(CD-GNP)通過共價鍵合到硫代聚合物上形成的多孔整體柱可用于CEC對映體的分離[12]。該柱對于佐匹克隆、氯苯那敏和托吡卡胺三對藥物對映體有著良好的分離效果，各對映體的保留時間、峰面積和Rs的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于1.8%、4.5%和4.4%。該柱在4 ℃ 條件下保存一個月以上，仍具有良好的重復(fù)性和對映體選擇性。

Khadka和El Rassi[13]合成了一種具有親水性液相色譜(HILIC)機(jī)理的毛細(xì)管整體柱，該柱由甘油或多胺羥丙基-β-CD(HP-β-CD)功能化制備而成。該毛細(xì)管柱性能穩(wěn)定，能同時分離對映異構(gòu)體和位置異構(gòu)體。雖然巴比妥和華法林對映體只實(shí)現(xiàn)部分分離，但苯丙氨酸可達(dá)到較好的手性拆分。

2 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)由于其與分析物在不同的微環(huán)境條件下具有獨(dú)特的相互作用(如手性或親和選擇性)而成為一類很有前途的整體性手性固定相(MCSP)材料。整體柱和蛋白質(zhì)兩者結(jié)合進(jìn)行對映體分離可以克服蛋白質(zhì)紫外吸收強(qiáng)、蛋白質(zhì)損失大、重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)。然而，目前僅有少數(shù)蛋白質(zhì)被用作CS，其中研究最多的用于修飾整體柱的蛋白是人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、胃蛋白酶(pepsin)和α-酸性糖蛋白(AGP)。

Lu等人[14]將BSA共價鍵合到硅膠上用于合成整體柱手性固定相，所制備的BSA-GNPs-硅膠整體柱在18 min內(nèi)成功地分離了10對苯硫氨基甲酰氨基酸(PTC-D/L-AAs)對映體。結(jié)果表明，以NP為基礎(chǔ)的手性固定相為維持BSA的構(gòu)象和獲得良好的手性分離能力提供了一個合適的微環(huán)境。由于納米材料在手性識別過程中具有獨(dú)特的優(yōu)勢，將毛細(xì)管硅膠整體柱和NPs結(jié)合起來進(jìn)行手性分離可能代表了進(jìn)一步研究的潛在趨勢[15-18]。

利用氨基修飾的介孔氧化硅納米粒子(NH2-MSN)，Xu等人[19]制備了一種poly(GMA-EDMA-NH2-MSN)基質(zhì)柱，之后以pepsin為CS，對基質(zhì)柱進(jìn)行表面功能化處理。由此制備成的整體柱被用于15種基本手性藥物的對映體分離，其中9種藥物實(shí)現(xiàn)基線分離，6種藥物部分分離。并且與未添加NH2-MSN的整體柱相比，含NH2-MSN的整體柱顯著提高了對所有分析物的手性分離選擇性。此外，Miao等人[20]將pepsin固定在羧基化單壁碳納米管(c-SWNTs)修飾的poly (GMA-co-EDMA)整體柱表面，可用于10種基本手性藥物的拆分。

將兩種CS即HSA和纖維素同時修飾在同一個poly (GMA-co-EDMA)基質(zhì)柱上所得的整體柱同樣可用于CEC手性拆分[21]。在pH 7的磷酸鹽緩沖溶液和有機(jī)溶劑(MeOH、iPrOH或ACN)存在的條件下，美托洛爾、比索洛爾、氮澤斯汀、艾司洛爾、華法林和色氨酸均能實(shí)現(xiàn)基線分離。但用單一CS制備的整體柱效果不如兩種CS共同修飾的整體柱，雖然也能獲得良好的手性拆分，但會出現(xiàn)峰展寬的情況。此外，該課題組[22]還通過原位共聚合席夫堿(SNW-1)、甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和二甲基丙烯酸乙酯(EDMA)制備了一種新型的基質(zhì)柱，然后將纖維素酶與該基質(zhì)柱進(jìn)行共價連接。該工作考察了SNW-1濃度、纖維素酶固定化所用pH值和CEC條件對分離結(jié)果的影響。通過條件優(yōu)化，7對不同類型的手性藥物可以實(shí)現(xiàn)基線分離，包括β-阻滯劑、抗組胺藥物和抗凝血藥物。

3 大環(huán)類抗生素

目前應(yīng)用最廣泛的大環(huán)類抗生素CS有萬古霉素、去甲萬古霉素、紅霉素、阿奇霉素和替考拉寧。這些CS具有不同的手性中心以及空腔、苯環(huán)、吡喃糖、呋喃糖、喹啉和噻唑環(huán)、供氫體和受氫體、糖基等基團(tuán)，因此在不同色譜條件下具有良好的手性選擇性。

據(jù)報道，通過大環(huán)抗生素與四甲氧基硅烷(TMOS)原位共聚，利用酸催化的溶膠-凝膠反應(yīng)可制備一種新型萬古霉素功能化的三維骨架的整體柱[23]。與后修飾的方法相比，一步法的步驟較少，同時也增加了配體負(fù)載量。結(jié)果表明該柱在反相色譜條件下對β受體阻滯劑具有良好的手性識別性能，而采用后修飾法合成的萬古霉素硅膠整體柱則無法獲得同樣的拆分效果。

以紅霉素為CS，Dixit等[24]制備了雜化毛細(xì)管整體柱。這種柱子集合了有機(jī)整體柱和無機(jī)整體柱的優(yōu)點(diǎn)，對pH、有機(jī)溶劑和溫度具有高度穩(wěn)定性，具有高傳質(zhì)和高滲透性等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)通過溶膠-凝膠法使氧化鋯與紅霉素的3-三乙氧基甲硅烷丙氨基甲酰化衍生物反應(yīng)。一些堿性化合物(普萘洛爾、西替利嗪、西酞普蘭、美托洛爾、舍曲林和吲達(dá)帕胺)能夠達(dá)到有效分離，Rs范圍在2.17～3.34之間。該柱重現(xiàn)性好，在pH 11.0時也具有良好的穩(wěn)定性。

4 離子交換試劑

在CEC中常用的另一類CS是基于離子交換機(jī)制的選擇劑，利用離子間的相互作用力將分析物引向CS的結(jié)合位點(diǎn)。其中奎寧、奎寧氨基甲酸酯、奎尼丁衍生物以及磷酸鹽、磺酸鹽等離子交換劑的應(yīng)用最為廣泛。

Buchinger等人[25]使用O-9-(叔丁基氨基甲?；?奎尼丁為選擇劑的整體柱拆分了雙氯丙酸、非諾普和異丙酚除草劑對映體。結(jié)果表明該方法具有良好的拆分能力、樣品裝載量、塔板數(shù)和峰對稱性。

Tran和Park[26]利用采用溶膠-凝膠法制備了一種由弱陰離子交換劑(奎寧)修飾的氧化鋯所制備的雜化整體柱。該柱在pH大于9.0時呈現(xiàn)陰極向電滲流(EOF)，pH小于9.0時為陽極向EOF，并對衍生化氨基酸(N-3, 5-二硝基苯甲酰基亮氨酸和苯甘氨酸)和一些酸性化合物(布洛芬、氟比洛芬、卡洛芬、酮洛芬、蘇洛芬、扁桃酸)等對映體實(shí)現(xiàn)了基線分離。

5 配體交換試劑

手性配體交換色譜法涉及到配體和對映體在金屬離子上的交換，配體交換基于配合物的金屬離子，配體和對映異構(gòu)體之間配位鍵的斷裂和形成。因此，含有給電子原子如氧、氮和硫的外消旋體可以在這些類型的CSPs上成功分離。最常用的CS是交聯(lián)聚苯乙烯樹脂和含有手性氨基酸的聚丙烯酰胺，以及在聚苯乙烯型基質(zhì)中含有L-脯氨酸的樹脂。

配體交換手性色譜法適用于給電子消旋體的拆分。有研究采用“一鍋法”設(shè)計(jì)了一種新的氨基酸表面活性劑為基礎(chǔ)的CEC整體柱體系[27]，利用優(yōu)化后的整體柱對(±)-偽麻黃堿(PEP)和(±)-麻黃堿(EP)同時進(jìn)行對映體拆分，并考察了氨基酸表面活性劑在手性識別過程中的作用。

Denizli等人[28]使用另一種氨基酸類的手性單體，即N-甲基丙烯酰-L-組氨酸甲酯(MAH)，制備了手性聚合物整體柱，采用CEC法成功分離了多種芳香胺類化合物，包括D/L-苯丙氨酸、D/L-酪氨酸和D/L-色氨酸。隨著MAH濃度的增加，α逐漸增大，表明這種新的氨基酸CS可以有效地用于對映體識別。

6 多糖

關(guān)于多糖這類CS，他們主要是基于直鏈淀粉或纖維素的手性特性提供立體選擇性相互作用。多年來，通過引入氨基甲酸苯酯基團(tuán)對這兩種CS進(jìn)行了改性處理，苯環(huán)進(jìn)一步被氯、氟、甲基、溴等取代基修飾[29]。這些基團(tuán)的存在極大地提高了這種CSP類型的對映體選擇性，同時伴隨著親和作用機(jī)制。

Lv等人[30]利用纖維素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(CDMPC)修飾的MCSP在CEC中手性拆分了一些酸性、中性、雙官能團(tuán)和堿性化合物，包括安息香、吲達(dá)帕胺、特羅格堿、安布西胺、奧沙西泮、華法林和氯滅鼠靈。

在最近的一項(xiàng)研究報道中[31]，CDMPC被涂覆在一個甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)組成的整體柱上，并與一個帶正電荷的單體進(jìn)行光催化反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)研究了光催化反應(yīng)和CS涂覆工藝，確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件。隨著帶電單體含量的增加(1.5～7.5 wt%)，EOF也隨之增加，最終實(shí)現(xiàn)了2-苯基-1-丙醇，特羅格堿和布洛芬的手性拆分。

此外，Sun等[32]采用納米級直鏈淀粉-2, 3-二(3, 5-二甲基苯氨基甲酸酯)(nano-ABDMPC)和nano-ABDMPC-二氧化硅修飾的雜交整體柱分離了6對對映體苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯乙醇、1-苯基-2-丙醇和特羅格堿。

7 分子印跡聚合物(MIP)

MIP是由模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑組成的混合物在非極性溶劑(致孔性溶劑)中聚合而成的。聚合后，通過溶劑萃取可除去模板分子，從而留下具有模板分子形狀的三維空腔。功能單體和交聯(lián)劑的種類和用量、功能單體與模板分子的摩爾比、多孔溶劑的種類等是影響MIP-CSP對映體選擇性的重要因素[33]。

有研究報道[34]以模板分子D-佐匹克隆(D-ZOP)、甲基丙烯酸(MAA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)為原料，合成了MIP毛細(xì)管柱，并通過CEC分離了佐匹克隆對映體。該研究考察了溫度、緩沖液濃度、聚合條件等因素對實(shí)驗(yàn)的影響。

由于受到帶有支鏈大分子結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，Song等人[35]以S-氨氯地平為模板分子，八乙烯基修飾的多面體低聚倍半硅氧烷(Ov-POSS)為交聯(lián)劑，甲基丙烯酸(MAA)為功能單體，制備了新型MIP整體柱。結(jié)果顯示氨氯地平的分離結(jié)果得到明顯改善，該柱具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。然而，一種MIP合成法僅適用于一種手性化合物的分析，效率低且有效性差，這可能也是其在CE應(yīng)用中有局限性的原因。

8 小結(jié)與展望

近年來，整體柱越來越受歡迎，具備一定的吸引力，由于其制備簡單、幾乎無限制的化學(xué)試劑選擇，而且不存在熔塊煅燒及其造成的后續(xù)問題，整體柱已成為CEC毛細(xì)管填充柱有力的替代方案。在CEC中，新型固定相的開發(fā)一直是研究的重點(diǎn)。隨著材料科學(xué)的發(fā)展，相繼出現(xiàn)了大量的創(chuàng)新材料，如金屬有機(jī)骨架(MOFs)、共價有機(jī)骨架(COFs)、多孔有機(jī)籠(POCs)、針織芳香族聚合物(KAPs)和深共熔溶劑(DESs)。然而，到目前為止，這些材料在MCEC對映體分離的應(yīng)用還很少。因此，CEC作為一種先進(jìn)的分析技術(shù)，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

此外，目前的研究主要集中在手性化合物的色譜分離方面，而在實(shí)際樣品分析中的應(yīng)用較少。實(shí)際上，隨著環(huán)境、食品工業(yè)和生物分析研究前沿的快速發(fā)展，對毛細(xì)管電泳應(yīng)用于實(shí)際樣品分離的需求日益迫切。未來的發(fā)展有望繼續(xù)探索新的高效手性改性材料，提高CEC分析實(shí)際樣品的能力?？偟膩碚f，整體柱在CEC領(lǐng)域的應(yīng)用仍然是一個很有前途的分離科學(xué)研究方向。