尿酸檢測方法的研究進(jìn)展*

江民川，趙 陽，馬芳芳，張 微，劉春葉

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

尿酸(2,4,6-三羥基嘌呤,uric acid，簡稱UA)是人體內(nèi)嘌呤代謝的最終產(chǎn)物。健康成年人血清中正常尿酸的水平為0.15～0.4 mmol/L。人體內(nèi)的尿酸異?？梢苑从吵鲟堰蚀x相關(guān)疾病，是多種疾病可能的遞質(zhì)。據(jù)《2017年中國痛風(fēng)報告白皮書》統(tǒng)計，中國高尿酸血癥患者人數(shù)已達(dá)1.7億。其中痛風(fēng)患者超過8 000萬人，并以每年9.7% 的增長率持續(xù)快速增加?，F(xiàn)代臨床研究表明，高尿酸血癥還與Lesch-Nyhan綜合癥、心腦血管疾病、內(nèi)分泌疾病、慢性腎臟、急性心肌梗死、腦梗死等疾病密切相關(guān)[1-3]，是這些疾病發(fā)生和發(fā)展的重要因素。因此有必要尋找一種快捷、方便、廉價、準(zhǔn)確的檢測方法對尿酸含量進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測。作者將對現(xiàn)有尿酸檢測方法進(jìn)行綜述，為該方法的發(fā)展提供參考。

1 常見尿酸檢測方法

1.1 磷鎢酸還原法

磷鎢酸還原法自1984年發(fā)明以來，不斷被改進(jìn)完善，現(xiàn)已成為比較成熟的尿酸含量檢測方法[4-6]。其檢測機(jī)理為在堿性條件下，磷鎢酸可將尿酸氧化成尿囊素和二氧化碳，同時自身被還原成鎢藍(lán)。經(jīng)過濾光板或紅色濾片濾除雜光,與同樣處理的尿酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色,根據(jù)顯現(xiàn)的顏色深淺程度不同，轉(zhuǎn)化成濃度曲線。該方法的不足是線性關(guān)系不強(qiáng)、尿酸和蛋白質(zhì)會產(chǎn)生沉淀、測試結(jié)果很容易受到其他還原物質(zhì)如維生素C的影響[5，7-8]。

1.2 高效液相色譜法

高效液相色譜(HPLC)是尿酸檢測的常見方法[9]，具有精密度高，分析速度快，樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)[10]。其檢測尿酸原理為在高壓輸液系統(tǒng)作用下，選擇相同極性的單一溶劑、不同比例的混合溶劑以及緩沖溶液等作為流動相，樣品在色譜柱中分離得出色譜圖，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法與尿酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較得出尿酸濃度。該方法缺點(diǎn)為樣品需進(jìn)行前處理、尋找合適的色譜條件、依賴高精密的儀器等[10-11]，一定程度上限制了推廣和應(yīng)用。

1.3 分光光度法

分光光度法是基于尿酸在293 nm處有特定吸收峰或尿酸與某些試劑作用生成具有特定吸收峰的物質(zhì)，因此分光光度法可分為直接吸光度法和間接吸光度法。前者根據(jù)樣品的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)尿酸溶液吸光度工作曲線作對比得出樣品尿酸濃度，例如用鐵氰化鉀紫外法檢測尿酸[12]；后者是根據(jù)尿酸轉(zhuǎn)化生成特定物質(zhì)的吸光度曲線，間接判定尿酸濃度，例如鐵-鄰二氮菲測量法[13]。分光光度法操作簡便、迅速，但靈敏度稍差，血漿等樣品中干擾物多且不易屏蔽，難以簡單地將血漿中的尿酸含量與吸光度測量值進(jìn)行比對，校正因子難以統(tǒng)一，線性擬合關(guān)系不夠[14-15]。

1.4 尿酸傳感器檢測法

尿酸傳感器主要分為電化學(xué)傳感器和生物傳感器。前者通過檢測尿酸在尿酸酶的作用下產(chǎn)生的電信號強(qiáng)度，從而得出尿酸濃度；后者主要通過生物活性物質(zhì)如酶，對尿酸的識別感應(yīng)進(jìn)行檢測。電化學(xué)傳感器具有靈敏度高、選擇性好、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)并逐漸成為尿酸檢測的熱門領(lǐng)域。電極材料不斷豐富以及電極材料修飾方式的多樣化[16-18]，為尿酸檢測提供了一種可行的方法。目前已經(jīng)有走出實(shí)驗室的產(chǎn)品如電化學(xué)尿酸儀，根據(jù)用戶反饋和專業(yè)機(jī)構(gòu)評估結(jié)果，尿酸儀測量結(jié)果有一定的價值，但重復(fù)性不好，單次測量易產(chǎn)生較大誤差[19-20]。

1.5 酶法

酶法是指在酶的參與下結(jié)合其他檢測手段共同完成對尿酸檢測的方法，如上述電化學(xué)傳感器中的一些方法也需借助酶的參與。酶法原理為測定酶促反應(yīng)后底物或者產(chǎn)物的濃度變化得出尿酸含量。根據(jù)直接定量的物質(zhì)，酶法可以分為間接尿酸酶法和直接尿酸酶法，當(dāng)考慮數(shù)據(jù)處理方法的不同，可分為平衡尿酸酶法和動力學(xué)尿酸酶法[21]。酶法的不足點(diǎn)在于測定尿酸時常伴有強(qiáng)競爭性酶抑制劑如黃嘌呤，酶的可獲得性低、成本較高[22]。另外各種酶法檢測需要特定條件，得出的結(jié)果不具有統(tǒng)一的評判標(biāo)準(zhǔn)，不具有可比性。

2 微流控紙芯片法

2.1 紙芯片法發(fā)展歷史

使用紙張作為檢測材料有著悠久的歷史。17世紀(jì)，英國化學(xué)家羅伯特·波義耳從一個意外的實(shí)驗發(fā)明了紫色石蕊試紙。近代以早孕試紙[23]為代表的免疫層析分析試紙[24]，即側(cè)向?qū)游鰴z測成為紙芯片檢測技術(shù)發(fā)展的一個轉(zhuǎn)折點(diǎn)。2007年，Whitesides研究組[25]提出在紙張表面加工出具有一定結(jié)構(gòu)的微流體通道，可用于葡萄糖等物質(zhì)的檢測，被認(rèn)為是現(xiàn)代微流控紙芯片研究的開端。Henry研究組[26]緊跟其后，提出將紙芯片與電化學(xué)檢測結(jié)合使用，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)比色法靈敏度低的缺陷。

2.2 紙芯片加工技術(shù)的進(jìn)展

隨著檢測物質(zhì)種類的增加和對檢測結(jié)果精確度要求的不斷提高，紙芯片加工技術(shù)也變得越來越多樣化。按照紙張?zhí)幚矸椒ǖ牟煌?，紙芯片加工技術(shù)可分為2種。物理修飾，即使用疏水試劑(如光膠、石蠟等)，對紙纖維的空隙進(jìn)行填堵，從而形成疏水堤壩，如紫外光刻技術(shù)[25-32]、繪圖技術(shù)[33-36]、蠟印技術(shù)[37-40]、噴墨打印技術(shù)[41-44]等；化學(xué)改性，利用化學(xué)反應(yīng)將疏水試劑鍵合在紙張纖維表面，例如烷基烯酮二聚體(AKD)[45-46]、十八烷基三氯硅烷(OTS)[47]等。再通過紫外光刻處理技術(shù)，將其降解在紙纖維表面，從而形成親水通道網(wǎng)絡(luò)。此外，也可采用空氣隔離技術(shù)，即依照需要的通道圖案，直接對濾紙進(jìn)行裁切或者雕刻，進(jìn)而形成“空氣-濾紙”界面的隔離帶，將流體控制在“通道”之中。

2.3 微流控紙芯片法檢測尿酸

利用微流控紙芯片對尿酸進(jìn)行檢測已有文獻(xiàn)報道。王方方等[48]通過光刻法，組裝出了一種三維紙芯片用于尿酸檢測，其檢測機(jī)理為將尿酸氧化酶和辣根過氧化酶固定在紙芯片上，尿酸被尿酸氧化酶催化生成H2O2，H2O2在辣根過氧化酶的催化作用下，發(fā)生魯米諾反應(yīng)而生成化學(xué)發(fā)光信號?；瘜W(xué)發(fā)光信號的強(qiáng)度與被分析物的濃度呈線性關(guān)系，通過對化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的檢測，可以完成尿酸的測量。該方法與電化學(xué)檢測方法相比較，檢測限降低了一個數(shù)量級，探索了紙芯片多元檢測的可能性。趙甜甜等[49]在筆中注入親脂性溶液，在濾紙上繪制圓形疏水圖案，將紙芯片作為實(shí)驗平臺，利用納米金團(tuán)聚顯色的特性，完成了血清中尿酸含量的快速檢測。Huang等[50]基于葡萄糖和尿酸產(chǎn)生H2O2介導(dǎo)的催化氧化顯色反應(yīng)，利用雙酶-無機(jī)雜化納米氧化物作為納米生物催化劑，建立了多重紙基納米生物催化體系，可以同時檢測葡萄糖和尿酸，檢測限分別為60和25 μmol/L，已成功地用于檢測人類全血樣本中的葡萄糖和尿酸水平。Wang等[51]以智能手機(jī)作為信號讀出器，研制出一種具有良好色度均勻性和強(qiáng)度的多層改性紙基比色傳感平臺，用于尿酸和葡萄糖的靈敏和選擇性測定，該方法在0.01～1.0 mmol/L對尿酸具有良好的線性響應(yīng)，在0.02～4.0 mmol/L對葡萄糖具有良好的線性響應(yīng)，檢出限分別為0.003和0.014 mmol/L，遠(yuǎn)低于之前的文獻(xiàn)報道。

微流控紙芯片檢測有著便捷、快速、綠色、廉價等特點(diǎn)，同時，微流控紙芯片生物檢測系統(tǒng)和電化學(xué)檢測系統(tǒng)分別在尿酸濃度與紙基顏色強(qiáng)度、電信號強(qiáng)度間建立了較強(qiáng)的線性關(guān)系，為其測量結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了保障。

3 結(jié)束語

除上述常見尿酸檢測方法外，還有一些權(quán)威檢測方法，如德國臨床化學(xué)會(DGKL)、美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院(NIST)、根特(Ghent)大學(xué)建立了血清尿酸檢測的參考方法——同位素稀釋-氣相色譜質(zhì)譜(ID-GC/MS)法[52-53]，中國國家計量院和衛(wèi)生部臨床檢驗中心建立UA同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜 (ID-LC/MS) 法和同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (ID-LC/MS/MS)法[54]。對比以上檢測方法，微流控紙芯片法具有諸多優(yōu)勢，也存在一些不足之處尚待解決。例如，要準(zhǔn)確測量全血中尿酸含量，需去除或降低干擾。尿酸檢測中存在的干擾包括物理干擾和化學(xué)干擾，例如采用比色法進(jìn)行全血測定時紅細(xì)胞自身顏色的干擾，氧化還原法測尿酸時共存還原性物質(zhì)如抗壞血酸、多巴胺的干擾。面對這些問題，可通過對樣品進(jìn)行簡單預(yù)處理，如添加某種試劑對干擾物質(zhì)進(jìn)行屏蔽、在紙張表面附加固定相來完成對干擾物質(zhì)的分離等方法進(jìn)行解決。同時采用固定容積的采血針將血稀釋成一定的倍數(shù)也可能使尿酸檢測簡化。目前微流控紙芯片技術(shù)還需不斷發(fā)展完善，紙上實(shí)驗室的構(gòu)建還存在較大發(fā)展空間。相信隨著紙芯片技術(shù)的發(fā)展，尿酸的檢測將會變得更加簡單，有望實(shí)現(xiàn)對全血中尿酸的實(shí)時檢測。