杜仲葉黃酮類化合物的提取純化及功能活性分析

王俊朋 ， 張立攀 ， 王春杰 ， 李 冰 ， 趙夢瑤 ， 關(guān)炳峰 ， 胡桂芳

(河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司 ， 河南 鄭州 450000)

杜仲是杜仲科植物，屬于我國特有品種，是一種珍貴的中藥材。杜仲在中國已有2 000多年的歷史，我國的杜仲種植面積廣泛，資源豐富。杜仲全身是寶，研究表明杜仲的種、皮、根、籽、葉等都具有很高的功能活性。杜仲皮和杜仲膠目前已經(jīng)被廣泛開發(fā)應(yīng)用，而杜仲葉的利用率卻很低。杜仲葉活性成分復(fù)雜，包括環(huán)烯醚萜類化合物、木脂素類化合物、黃酮類化合物、杜仲膠、苯丙素類化合物、酚類化合物、氨基酸、多糖類物質(zhì)、維生素、脂肪酸，具有抗氧化、抗疲勞、降血脂等功效。中醫(yī)很多古籍有載杜仲入肝、腎，有補(bǔ)中益氣、堅筋骨、強(qiáng)志、安胎之功效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)杜仲有降壓、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗突變、抗癌、抑制細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、增強(qiáng)免疫力、利尿、減肥作用，以及有利于骨骼健康的作用[1-5]。

然而，目前針對杜仲的資源開發(fā)應(yīng)用比較狹隘，主要局限于杜仲皮和杜仲膠，杜仲自古以來將杜仲皮入藥使用。杜仲膠作為一種天然高分子材料，和合成橡膠成分類似，常用于航空、航天、國防、化工等領(lǐng)域，因其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性能。而資源更為豐富的杜仲葉卻尚未被深度開發(fā)利用，因缺乏有效的加工方式，造成資源的浪費(fèi)[6]。研究表明杜仲葉(Eucommia Folium)與杜仲皮活性功能成分和藥理作用一致。目前已知的經(jīng)過分離純化并鑒定出來的杜仲有機(jī)化合物約有70種以上，礦物質(zhì)達(dá)15種以上。杜仲屬于可再生利用資源，主要分布于我國河南、陜西、甘肅、湖北等地，種植面積廣泛，產(chǎn)量巨大。杜仲葉中含有豐富的活性成分，如黃酮、綠原酸等，近年來總黃酮的研究一直都備受關(guān)注。研究表明，杜仲不同部位的總黃酮含量差別很大，以老葉中總黃酮含量最高。如果能夠?qū)S酮類化合物的藥用價值進(jìn)行充分開發(fā)利用，將杜仲的天然成分應(yīng)用到各行業(yè)領(lǐng)域，那么對整個食品行業(yè)會具有積極的助推作用[7-9]。

本文對杜仲葉的化學(xué)成分、黃酮類化合物的提取方法、黃酮類化合物的分離純化、功能活性研究等進(jìn)行綜述，期望對杜仲葉中黃酮類化合物的綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 杜仲化學(xué)成分分析

杜仲各部位的主要成分基本相似，經(jīng)實驗檢測分析從杜仲皮、葉中分離得到的化學(xué)成分如下：木脂素及其苷類、環(huán)烯醚萜類成分、杜仲膠、甾萜類化合物、酚類化合物、脂肪酸、維生素、氨基酸及微量元素、黃酮類化合物等。其中黃酮類化合物主要包括槲皮素、莰菲醇、山奈酚、紫云英苷、陸地錦苷以及3-O-[β-D-吡喃葡糖-(1-2)-β-D-吡喃木糖]-槲皮素黃酮苷等[10]。

2 杜仲葉黃酮類化合物的提取

目前杜仲葉中總黃酮的提取方法主要有水提法、溶劑法、超聲波提取法、微波提取法、超臨界CO2萃取法、酶解法和半仿生提取法[11]。

2.1 水提法

水提法是利用水蒸氣和被蒸餾組分不相容的原理，使被分離物質(zhì)能在比原沸點低的情況下隨著水蒸氣一起逸出。將杜仲葉粉碎后，按一定的料液比浸入水中，在適宜的溫度下浸提一定時間，從而得到含有杜仲葉有效成分的浸提液。水提法以水為溶劑，利用黃酮類化合物易溶于水的原理進(jìn)行提取。水提法提取液黏度大，過濾濃縮困難，提取物容易發(fā)生霉變。張亦琳等[12]利用雙水相分離純化杜仲黃酮類化合物，經(jīng)過條件優(yōu)化得在50%的乙醇濃度，20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的KH2PO4情況下，杜仲葉總黃酮的萃取率達(dá)77.94%。何德飛等[13]利用水提法提取杜仲葉中總黃酮，發(fā)現(xiàn)料液比1∶16，萃取時間24 h，杜仲葉有效成分溶出最多。

2.2 溶劑法

溶劑法是一種傳統(tǒng)的提取方法，根據(jù)原料中被提取成分的理化性質(zhì)及極性特征，利用相似相容的原理將其中的有效成分從固體組織中轉(zhuǎn)移到液體或氣體中。杜仲葉中黃酮不僅易溶于水，通過水提方法分離，還易溶于乙醇、甲醇、乙醚等有機(jī)溶劑。劉軍海等[14]用丙酮-水為溶劑提取杜仲葉中黃酮，在料液比1∶16，提取溫度65 ℃，提取時間2 h時最佳，最佳提取率達(dá)1.86%，總黃酮含量10.96%。杜仲中的活性成分多數(shù)是溶于極性物質(zhì)的，乙醇是使用最普遍的一種有機(jī)溶劑，但是由于提取過程雜質(zhì)較多，對后期的純化不利。趙文紅[15]通過醇提杜仲葉中黃酮類化合物，得出最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度50%，80 ℃下回流60 min，黃酮得率為3.18%。

2.3 超聲提取法

超聲提取法原理是利用超聲波輻射產(chǎn)生的空化、震蕩、乳化、擴(kuò)散等多級效應(yīng)，使物料的細(xì)胞壁加速破裂，增大穿透力，使溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到提取的目的。黃酮類化合物屬于胞內(nèi)物，傳統(tǒng)的水提和醇提工藝提取率較低，因此需要破壞細(xì)胞壁才可以增加其溶出率。王柏強(qiáng)等[16]通過單因素和正交試驗優(yōu)化超聲波輔助提取杜仲葉黃酮的工藝，分別選擇纖維素酶用量為30 mg，料液比1 g∶30 mL，酶解pH值5.0，酶解溫度45 ℃作為影響因素，然后在溫度50 ℃下超聲15 min。此工藝條件下，總黃酮提取率為3.08%。與傳統(tǒng)提取方法比起來具有提取條件溫和，溶劑用量少，有效成分提取率高，減少環(huán)境污染等優(yōu)點。袁英髦等[17]通過超聲輔助提取杜仲皮中的黃酮，發(fā)現(xiàn)超聲頻率控制在40 kHz時，隨著功率的升高、時間的延長提取率呈增長趨勢。超聲輔助提取法振蕩頻率增加會加速有效成分在溶劑中的擴(kuò)散和溶出，能夠大幅度的縮短溶劑提取時間，降低提取溫度，提高黃酮的提取率[18]。超聲波還適用于對熱敏感的成分提取。超聲波提取法的特性有：①超聲波在氣液固三種介質(zhì)中均可以有效的傳播，應(yīng)用范圍廣泛。②超聲波通過傳播高能量達(dá)到破壞細(xì)胞壁的目的。③超聲波會產(chǎn)生一些反射、疊加和共振等現(xiàn)象，在傳播介質(zhì)中會產(chǎn)生沖擊或空化，加速傳播速度。

2.4 微波提取法

微波提取法的原理是利用微波輻射穿透溶劑到達(dá)細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生的磁場能加速被萃取成分快速從固體向固液界面轉(zhuǎn)移，微波的振動頻率和分子的振動頻率相關(guān)聯(lián)，迅速產(chǎn)生熱能加速被提取物質(zhì)分子的熱運(yùn)動，使細(xì)胞壁快速破壞，從而提高有效成分的溶出率和提取率。劉桂萍等[19]以杜仲葉粉為原料，通過單因素和正交實驗確定微波輔助提取黃酮的工藝條件，當(dāng)料液比1∶25，功率320 W，提取時間2.5 min時提取率可達(dá)8.7%。該方法作為一種新型提取工藝，其最大的特點就是能促使極性分子加速溶出，加熱迅速、節(jié)能、環(huán)保、方便操作控制，能縮短提取時間，非常適合應(yīng)用于杜仲葉黃酮工業(yè)化提取，但是該方法不適用于非極性物質(zhì)的提取。

2.5 超臨界CO2萃取法

傳統(tǒng)的溶劑法具有高提取率的優(yōu)點，但是也有需要回收溶劑的缺點，而且對提取溫度要求比較高。超臨界CO2利用是指處于超臨界狀態(tài)的CO2作為溶劑應(yīng)用于對物料進(jìn)行分離提取的一種技術(shù)，優(yōu)點是萃取時間短、節(jié)能費(fèi)用、環(huán)保。超臨界萃取是通過溫度和壓力調(diào)節(jié)控制其溶解性的。王華芳等[20]以杜仲葉為原料，通過研究超臨界CO2萃取黃酮的工藝條件得到萃取溫度50 ℃，萃取壓力30 MPa，萃取時間120 min時，提取率達(dá)10.55%。

此方法具有諸多優(yōu)點：①萃取速度高于液體萃取，比較適合提取固體物料中的有效成分。②能耗低，適合應(yīng)用于熱敏性、易氧化物質(zhì)的提取。③溫度容易控制，熱量傳播速度快。④針對一些易揮發(fā)性成分也能達(dá)到分離的目的[21]。

2.6 酶解法

中草藥成分復(fù)雜，包括蛋白質(zhì)、果膠、植物纖維等多種非必需成分，植物細(xì)胞壁和這些成分會阻礙一些被提取有效成分的溶出，利用酶反應(yīng)去除一些特定結(jié)構(gòu)可用于提高有效成分的釋放速度。酶解法提取是通過合適的酶來處理杜仲葉，使組成杜仲葉細(xì)胞的纖維素、果膠等成分遭到破壞，從而提高胞內(nèi)有效成分的溶出速率。陳曉娟等[22]通過酶法提取杜仲葉中黃酮，分別考察果膠酶用量、酶解時間、料液比、pH值等因素，并通過正交試驗得出最佳工藝參數(shù)，在果膠酶用量1.5 mL，80 ℃下酶解2 h時，黃酮得率為0.043%。酶解法提取具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、提取效率高、節(jié)能等特點，能夠使有效成分快速溶解，在成分復(fù)雜的中藥材提取方面具有重大的應(yīng)用意義[23-24]。

2.7 半仿生提取法

半仿生提取法(簡稱SBE法)，主用用于中藥制劑。半仿生法是將藥料使用酸水和堿水順序提取，繼而將提取液分別過濾、濃縮，制成制劑，利用模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的原理，為經(jīng)消化道給藥的中藥試劑提供的一種提取工藝。以杜仲葉為原料，以磷酸氫二鈉-檸檬酸的緩沖溶液作為提取液，通過正交試驗優(yōu)化半仿生法提取黃酮工藝，當(dāng)杜仲葉∶提取液=1∶20時，最終黃酮的得率為0.044%[25]。半仿生提取法的特點：①提取過程符合中醫(yī)配伍、臨床用藥特點、口服藥物在胃腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)特點；②最大限度地保留有效成分，并且活性成分損失較少；③不僅能使混合物充分發(fā)揮其綜合作用，又能利用單體成分控制質(zhì)量。因此，該方法在中藥的有效成分提取和配方研究中有良好優(yōu)勢和廣泛的應(yīng)用前景[26]。

3 杜仲中黃酮類化合物的分離純化

3.1 薄層層析色譜法

馬柏林等[27]以十二烷基硫酸鈉-正丁醇-正庚烷-水微乳液作為展開劑，通過聚酰胺薄層色譜對杜仲葉黃酮進(jìn)行簡單分離，效果良好。

3.2 大孔吸附樹脂

大孔吸附樹脂是一類不含交換基團(tuán)的有機(jī)高分子聚合物，是柱色譜常用的一種吸附劑，因其處理量大、分離效果好而被廣泛應(yīng)用于黃酮類物質(zhì)的分離純化。付桂明等[28]通過大孔樹脂對杜仲葉黃酮物質(zhì)進(jìn)行富集純化，發(fā)現(xiàn)AB-8樹脂的吸附率和解吸率最高，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)從10.2%升到42.6%。潘瑩[29]篩選D101-1大孔樹脂吸附純化杜仲黃酮，分離純化效果顯著，使純度升為54.43%。張玲等[30]對杜仲葉黃酮類化合物進(jìn)行分離純化，從9種樹脂中篩選純NKA-Ⅱ，分離效果良好，最終得到4種組分，分別為綠原酸、金絲桃苷或陸地錦苷、槲皮素-乙酰糖苷和槲皮素。

4 杜仲中黃酮類化合物的生物活性

黃酮類化合物廣泛分布在植物中，因其結(jié)構(gòu)的多樣性以及不同的類型，所表現(xiàn)出生物活性和功能也不相同，具體如下。

4.1 抗氧化活性

黃酮類化合物屬于多酚類物質(zhì)，抗氧化活性強(qiáng)，基本無毒副作用。黃酮類化合物的抗氧化機(jī)制主要表現(xiàn)在以下兩方面：①鏈的中斷機(jī)制，黃烷和原花青素等黃酮類化合物在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中能切斷自由基鏈，以達(dá)到抗氧化的目的。②促使產(chǎn)生自由基的催化劑失活，對體內(nèi)酶的作用，黃酮類化合物分子中富含酚羥基，與酶蛋白分子結(jié)合，抑制相關(guān)酶的活性。對金屬離子的作用，黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中的羰基或相鄰的羥基可以與金屬離子形成五元或六元的配合物，從而清除引發(fā)活性自由基產(chǎn)生鏈反應(yīng)的催化劑。羅飛華等[31]對杜仲葉黃酮提取物進(jìn)行抗氧化活性分析，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有較強(qiáng)的還原能力，具有顯著的超氧陰離子清除能力。

4.2 抗疲勞活性

楊津等[32]通過動物實驗研究杜仲葉中黃酮類化合物對小鼠抗疲勞作用的影響，通過觀察對照組和黃酮苷給藥組，發(fā)現(xiàn)黃酮苷給藥組負(fù)重游泳時間延長，小鼠血清中超氧化物歧化酶含量升高，說明杜仲葉黃酮苷具有顯著的抗疲勞作用。

4.3 降血糖活性

沈伊濛等[33]通過正交試驗研究杜仲葉黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響，并對杜仲葉黃酮含量進(jìn)行分析測定，含量達(dá)18.12%。邢冬杰等[34]探討杜仲葉黃酮對高血糖火鼠血糖的控制，建立糖尿病大鼠模型，設(shè)定實驗組和對照組，每日給藥連續(xù)28 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)杜仲葉黃酮能明顯降低糖尿病大鼠中胰腺組織的丙二醛水平，升高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平。

4.4 降血脂活性

杜仲葉黃酮的降血脂作用，通過建立動物模型，并進(jìn)行分組給藥按照大中小三種劑量的黃酮水平分別對實驗組灌胃操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥組的血漿總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇含量等顯著降低，高密度脂蛋白膽固醇、過氧化氫酶等有所上升，證明黃酮對降血脂具有顯著效果。雷燕妮等[35]探索杜仲葉黃酮降血脂作用，通過建立高血脂動物模型，分析對照組和高血脂模型組的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)杜仲葉總黃酮能顯著降低高血脂小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇的含量，高密度脂蛋白膽固醇的含量有升高趨勢，說明其具有顯著的降血脂作用。

4.5 降血壓活性

雷燕妮等[36]采用微波輔助法提取杜仲葉黃酮類化合物，并建立高血壓小鼠動物模型，通過對照組和給藥組結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物能顯著降低給藥組的血壓水平。目前杜仲中已知的降血壓成分為脂素類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類和黃酮類[37]。

5 展望

杜仲是我國獨(dú)有的經(jīng)濟(jì)物種，資源豐富，杜仲的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用主要在生態(tài)園林綠化、醫(yī)療保健和食品開發(fā)、橡膠的應(yīng)用等，杜仲在食品領(lǐng)域的應(yīng)用主要是功能食品開發(fā)。杜仲皮、杜仲膠目前已經(jīng)達(dá)到了很高的產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用，但是資源豐富的杜仲葉并未被全面開發(fā)應(yīng)用，長期以來，杜仲葉被用于動物飼料，造成資源極度浪費(fèi)[38]。杜仲葉化學(xué)成分復(fù)雜，很多被研究證明具有藥理活性，如抗氧化、抗疲勞、降血壓、降血脂等[39]。但是其在臨床試驗中使用范圍較窄，導(dǎo)致杜仲中成藥品種較少。目前很多的活性功能機(jī)理研究還不夠透徹，本文以杜仲葉中黃酮類化合物為例，對其提取工藝、分離純化方法、功能活性等進(jìn)行匯總。研究證明杜仲葉黃酮類化合物具有很多功能活性，但是目前機(jī)理尚不明晰，需要進(jìn)一步的研究充分證明。筆者認(rèn)為，杜仲葉的應(yīng)用方向主要為：①將杜仲葉的活性成分進(jìn)行分離純化鑒定，如杜仲葉黃酮類化合物的純化鑒定及功能活性分析；②開發(fā)出更多的杜仲葉功能性食品，如杜仲茶、杜仲飲料、杜仲酒等。21世紀(jì)大健康食品和營養(yǎng)食品發(fā)展空間巨大，目前人們對純天然的植物產(chǎn)品備受青睞，這給杜仲葉產(chǎn)品的開發(fā)帶來很大的機(jī)遇和挑戰(zhàn)，對大健康產(chǎn)業(yè)也具有很大的助推作用。