體外誘導羊膜上皮細胞轉分化為雌性生殖細胞的實驗研究

劉心蕊，蒲靜，李雪，潘朋歌，張寧

（寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004）

0 引言

近年來，在社會、環(huán)境及個人等多方面因素的綜合影響下，全球范圍內不孕不育的發(fā)病率不斷提升，由此也引發(fā)了全球醫(yī)療的廣泛關注。目前對于不孕不育的治療，臨床上所應用的輔助生殖技術雖然種類很多，但對于生殖細胞缺陷諸如卵巢早衰的患者始終無法達成很好的治療效果。早在2003年國外研究人員就成功的從胚胎干細胞體外誘導出了卵母樣細胞，由此也對諸多的不孕患者帶來了全新的生機與希望。但需要強調的是胚胎干細胞高表達端粒酶具有著較為突出的致瘤性。此外，還有研究證實，羊膜上皮細胞同樣具有著突出的多樣性特點，同時能夠表達潛能干細胞特定的轉錄因子，但對于干細胞中的端粒酶基因并不能表達，其來源又源自于廢棄胎盤，并無倫理學爭議[1-2]。而且，從大量的體外研究也均有力的證實了hAECs所具有的向3個胚層細胞分化的能力。對此，本次研究特使用人卵泡液為誘導劑，針對hAECs的作用從生態(tài)學和基因蛋白水平進行了觀察，旨在為生殖細胞缺如女性不孕患者的治療提供可靠參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料。采用我院產科近1年行剖宮產分娩的健康產婦胎盤組織，經血清學和病毒學檢測結構呈陰性，并從經輔助生殖技術體外受精助孕的婦女中提取卵泡。研究均經患者知情且同意。此次研究中所應用的主要試劑包括：DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、人上皮生長因子、胰蛋白酶、PCR引物、PCR試劑盒、DAZL山羊多克隆抗體等。

1.2 實驗方法

1.2.1 hAECs分離培養(yǎng)及鑒定：針對羊膜與絨毛膜進行鈍性分離，并將其放置于含有雙抗的培養(yǎng)液中進行反復多次沖洗。沖洗完畢使用眼科剪將其剪成小塊，隨即加入37℃、0.05%的胰蛋白酶，震蕩消化處理10 min。隨后將上層清液吸除，再加入37℃、0.05%的胰蛋白酶震蕩消化30 min.結束后再使用10%血清的DMEM培養(yǎng)基進行終止消化處理。隨即使用網篩過濾取200×g細胞懸液，并進行4℃恒溫離心處理10 min，后以1×107密度于培養(yǎng)瓶中接種，并將其放置于5%、37℃的是否為無菌細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)2～3 d。隨后進行換液，待培養(yǎng)細胞增長至80%融合后傳代。使用顯微鏡針對原代細胞細胞形態(tài)變化進行觀察，并采用RT-PCR和免疫細胞化學進行檢測證實，證明：原代hAECs能夠實現上皮細胞特異性細胞角蛋白19和Oct-4基因的表達。

1.2.2 hAECs的誘導分化處理：選取已完成細胞融合80%的第一代hAECs，均分對照組與誘導組兩組并給予差異化處理，其中對照組EMMA培養(yǎng)基中含5%的胎牛血清、5000U 肝素鈉以及2 mmol/L的L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L的非必需氨基酸、0.1 mool/L的β-巰基乙醇，觀察組中在對照組添加的基礎上再添加5%的人工卵泡。兩組培養(yǎng)基每間隔3 d進行1次更換。針對培養(yǎng)基用域E2檢測含量檢測的上清液進行收集，并再顯微鏡下針對兩組細胞形態(tài)變化進行觀測，在誘導兩周后（14 d）針對兩組細胞總RNA和蛋白進行分別搜集。

1.2.3 RT-PCR檢測基因表達：對所搜集的兩組RNA，依據逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA合成，并在定量PCR儀上使用PCR試劑盒進行PCR擴增，具體反應條件為：DAZL基因 95℃ 2 min，95℃ 10s，56℃ 10 s，72℃15s，總計39個循環(huán)。GDF9與SCP3和β-actin反應條件為95℃ 2 min，95℃ 10s，56℃ 10s，72℃ 15s，同樣供39個循環(huán)。針對PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳處理，針對增產物的純度、GDF9、SCP3、DAZL基因表達進行觀察。針對內參基因β-actin與目標基因的比值進行計算。

1.2.4 蛋白表達檢測：待完成14d的誘導處理之后，使用含有coktail的蛋白裂解液RIPA分別對兩組細胞進行誘導裂解處理，待經超聲離心處理后對其蛋白上清進行收集，并針對兩組的蛋白濃度使用紫外分光光度計進行測定，并使用凝膠成像掃描系統(tǒng)完成掃描。以DAZL與內參β-actmin的光密度比值界定為DZAZL蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理。所有實驗均重復進行3次，最終結果以（±s）表示，組間差異使用χ2檢驗，P＜0.05，說明組間差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 hAECs形態(tài)學特征與鑒定結果分析。結果顯示，原代hAECs生長較快，經2～3 d的培養(yǎng)后可達成80%～90%的高度融合。當原代hAECs傳遞至第3代之后，細胞生長速度與貼壁率下降明顯，hAECs由于端粒酶的缺乏無法實現無限增殖，故后續(xù)實驗特使用1代hAECs代替。

2.2 培養(yǎng)上清液中E2水平變化觀察。經化學發(fā)光免疫檢測技術檢測顯示，在14d的誘導處理過程中，對照中并無E2生成，誘導組中存在E2生成，其基礎含量經測定約為（1.76±0.08）×104PG/ML，至第4其含量降至（0.96±0.06）×104PG/ML，隨后呈現逐步增加趨勢，至誘導第10d達到最高值，為（2.55±0.07）×104PG/ML。

2.3 RT-PCR檢測生殖細胞特異性基因表達分析。在經過14 d誘導處理后，含由5%人卵泡液的誘導組與對照組相比，生殖細胞特異性基因GDF9和DAZL的mRNA含量明顯較高，P＜0.05，而SCP3的mRN表達量則無明顯差異，P＞0.05。

2.4 Western blot檢測與DAZL蛋白表達。結果顯示，經14 d誘導處理后誘導組DAZL基因表達水平為（0.704±0.031），而對照組為（0.172±0.03），P＜0.05。

3 討論

隨著現代醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，胚胎干細胞向生殖細胞分化的實現也使得通過干細胞一直來治療不孕不育成為了可能。人羊膜上皮細胞，源自于受精8d后的原腸胚形成之前的外胚層，也具有了原腸胚形成前期胚胎干細胞的可塑性。通過查閱近期研究也可發(fā)現，hAECs在不同的微環(huán)境調控與生長因子刺激下是可以分化為3個胚層不同類型細胞的，也能夠完成多潛能干細胞特定轉錄因子oTC-4和Nanog的表達，由此也說明hASCs具有了與ESCs類似的多向分化功能。此外，hASCs不能對干細胞的端粒酶基因進行表達，因此也不具備無限增殖的功能和致瘤性。此外，國內研究表示，人工羊膜上皮細胞具備抗炎因子分泌功能，因此也能夠有效的預防移植后炎癥反應的發(fā)生[3-4]。

在此次研究實驗中，使用人卵泡液為誘導劑，在經歷為期14d的誘導之后，通過對細胞融合生長的觀察發(fā)現，其形態(tài)學改變與前人研究成果高度一致。結果顯示，DAZL基因在生殖細胞的發(fā)育早期就已經開始表達，屬于減數分裂前期生殖細胞的標志基。GDF9屬于卵母細胞分化后期的特異標志，而SCP3則是對哺乳動物減數分裂轉變檢測的高度特異性標志。在實驗中通過RT-PCR技術針對誘導組細胞進行檢測，發(fā)現生殖細胞特異性基因（GDF9、DAZL）的mRNA表達水平相對較高，而SCP3的基因表達則于對照組無明顯差異，并通過使用Western blot方法對DAZL蛋白表達水平的檢測發(fā)現，對照組基因表達量相對較高。由此也有力的證實了：人卵泡液能夠實現在體外誘導hAECs向雌性生殖細胞方向成功轉化，但該細胞并不具備減數分裂的能力。

總而言之，通過此次研究可以得出結論：人工卵泡能夠誘導hAECs向雌性生殖細胞方向轉分化，由此也為生殖細胞的體外誘導分化提供了一種全新的干細胞來院，為不孕不育患者的治療帶來了全新的生機和希望。但需要明確的是，在此次研究中卵細胞生成并未明確，而且所身生成的生殖細胞也不具備減數分裂的能力，因此無法得到成熟的卵細胞，這也是需要后期投入更多的時間和精力去深入探索研究的。