中藥抗流感病毒活性研究方法發(fā)展現(xiàn)狀

錢秀玉，聶黎行*，張 毅，戴 忠，馬雙成

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 401121）

流行性感冒病毒簡稱流感病毒，屬正黏病毒科，包括人流感病毒和動(dòng)物流感病毒。人流感病毒根據(jù)其核蛋白的抗原性分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒的病原體。其中，甲型流感病毒抗原性易發(fā)生變異且傳染性較強(qiáng)，是引發(fā)季節(jié)性流感和全球大流行的主要病毒[1]。高變異性和高致病性流感病毒的流行，將會(huì)造成巨大的社會(huì)健康危機(jī)和生命損失。20世紀(jì)至今，已爆發(fā)多次流感世界大流行，1918年在西班牙爆發(fā)的H1N1流感直接或間接造成全世界近5000萬人口死亡，此后1957，1968和2009年的3次大流感疫情也造成了巨大損失。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，每年有29～65萬人的死亡與流感引起的呼吸道疾病有關(guān)[2]，對(duì)全球人類的健康造成嚴(yán)重的威脅。

中藥在流感治療中發(fā)揮著重要作用。許多單味中藥和復(fù)方中藥，如板藍(lán)根、黃芩、金銀花、連翹、連花清瘟膠囊、銀翹散、雙黃連制劑等[2]，在臨床上廣泛用于流感的預(yù)防與治療，通過直接抑制病毒作用或/和免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮抗流感病毒作用，臨床效果明顯。研究中藥抗流感病毒活性和機(jī)制有利于新藥發(fā)現(xiàn)和指導(dǎo)藥物臨床應(yīng)用，提高疾病的治愈率。目前，按照研究對(duì)象分類，現(xiàn)有的中藥抗流感病毒活性和機(jī)制研究方法可分為體外、體內(nèi)及酶/蛋白質(zhì)/mRNA方法。體外方法多以細(xì)胞/細(xì)胞系為模型，體內(nèi)方法包括雞胚、小鼠、大鼠、樹鼩等模型和人體臨床試驗(yàn)。本文將對(duì)中藥抗流感病毒活性和機(jī)制研究的多種方法進(jìn)行詳細(xì)綜述，以期為相關(guān)研究提供有益參考。

1 流感病毒概述

流感病毒是正黏病毒科的分節(jié)狀單鏈負(fù)義RNA病毒，由包膜、基質(zhì)蛋白及核心3個(gè)部分構(gòu)成。包膜除磷脂分子外，含有兩個(gè)重要的糖蛋白：血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）。HA水解后的重鏈部分與宿主細(xì)胞膜上的唾液酸受體相結(jié)合，輕鏈部分協(xié)助病毒包膜與宿主細(xì)胞膜相互融合，在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過程起重要作用[3]。NA是呈蘑菇狀的四聚體，可催化唾液酸水解，協(xié)助成熟流感病毒與宿主細(xì)胞脫離，釋放成熟流感病毒?；|(zhì)蛋白（M1）和膜蛋白（M2）組成病毒的外殼骨架，保護(hù)病毒核心和維系病毒空間結(jié)構(gòu)。病毒核心中的遺傳物質(zhì)單股負(fù)鏈RNA（ss-RNA）和核蛋白（NP）相結(jié)合，形成核糖核蛋白體（RNP）。此外，核心中還含有負(fù)責(zé)RNA轉(zhuǎn)錄的RNA多聚酶[4]。

流感病毒感染宿主細(xì)胞的過程為吸附、內(nèi)吞、融合、復(fù)制、翻譯、裝配、出芽和釋放[5]。目前抗病毒小分子藥物有NA抑制劑、M2 離子通道阻滯劑、HA抑制劑、NP抑制劑等[6]。A/PR/8/34（H0N1）、A/FM/1/47（H1N1）、A/Hongkong/1/68（H3N2）、A/Anhui/1/2013（H7N9）等是甲型流感病毒亞型代表病毒株。流感病毒能在雞胚羊膜腔和尿囊腔中增殖，可在組織培養(yǎng)細(xì)胞（人羊膜、猴腎、狗腎、雞胚等細(xì)胞）中增殖，在雪貂、小鼠及大鼠體內(nèi)易感[7]。

2 體內(nèi)/體外研究模型

2.1 體外研究模型

犬腎細(xì)胞（MDCK細(xì)胞）、RAW264.7細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞）、16HBE細(xì)胞（人支氣管上皮樣細(xì)胞）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）等是常見的抗流感病毒體外細(xì)胞/細(xì)胞系模型，用于流感病毒感染和增殖，其中MDCK細(xì)胞最為常用[8-10]。體外細(xì)胞/細(xì)胞系模型主要應(yīng)用于中藥抗流感病毒藥物安全性評(píng)價(jià)、抗病毒活性及作用機(jī)制研究。細(xì)胞存活率、生長抑制率、細(xì)胞保護(hù)率、病毒載量等常作為表征中藥的抗流感病毒活性的指標(biāo)。

2.1.1 細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE） 肖平等[11]研究板藍(lán)根活性部位及代表性化合物抗流感病毒活性，用CPE法測定藥物作用后的存活病毒，并按Reed-Muench法[12]計(jì)算滴度（TCID50），采用CPE法評(píng)價(jià)其治療作用，以細(xì)胞保護(hù)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明，F(xiàn)M1病毒感染細(xì)胞后觀察到明顯的細(xì)胞病變，經(jīng)Clemastanin B、表告依春、苯丙素類組分、苯丙素類+生物堿+有機(jī)酸組分處理后，均未見明顯的CPE形成。其中，苯丙素類組分對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用最為顯著，說明以上組分對(duì)流感病毒有一定的抑制作用。

2.1.2 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法） 李征途等[13]通過MTT法檢測板藍(lán)根多糖對(duì)16HBE細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，將16HBE細(xì)胞接種到96孔板培養(yǎng)，不同濃度的板藍(lán)根多糖作用于細(xì)胞，培養(yǎng)后加入MTT溶液，孵育后吸去上清，將甲臜晶體溶解于DMSO中，使用96孔微板分光光度計(jì)在570 nm波長下測量吸光度。結(jié)果表明，在3.75～30 mg/ml濃度范圍內(nèi)，板藍(lán)根多糖對(duì)16HBE細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性。魏文揚(yáng)等[14]采用MTT法研究麻黃湯體外抗甲型H1N1流感病毒作用。結(jié)果表明，在為2.50～5.00 g/L濃度范圍內(nèi)，麻黃湯通過抗病毒生物合成抑制流感病毒，且抑制作用強(qiáng)于陽性藥物達(dá)菲。

2.1.3 流式細(xì)胞術(shù) 劉曉靜等[15]研究3種中藥（金銀花、黃芩和連翹）提取液的抗流感病毒作用，試驗(yàn)中用藥物和病毒分別作用和感染MDCK細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組（細(xì)胞）、病毒對(duì)照組（病毒+細(xì)胞）、藥物對(duì)照組（藥物+細(xì)胞）、藥物試驗(yàn)組（藥物+病毒+細(xì)胞），以利巴韋林作為陽性藥物對(duì)照，細(xì)胞病變達(dá)1/3時(shí)收集細(xì)胞，用Annexin V/PI（Annexin V/PI與正常和凋亡細(xì)胞的結(jié)合情況不同）雙染細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，計(jì)算3種提取液對(duì)由流感病毒引起的MDCK細(xì)胞凋亡抑制率。結(jié)果表明，濃度為7.81 g/L的黃芩和連翹提取液對(duì)甲3型流感病毒誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞凋亡有抑制作用。楊慧等[16]采用流式細(xì)胞術(shù)研究魚腥草抗甲Ⅰ型流感病毒誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞凋亡作用，計(jì)數(shù)魚腥草作用后病毒感染的MDCK細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，藥物試驗(yàn)組比病毒感染對(duì)照組細(xì)胞凋亡率偏低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明魚腥草能抑制由甲Ⅰ型流感病毒誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞凋亡。周艷萌等[17]采用流式細(xì)胞術(shù)研究厚樸及其提取物體外抗流感病毒H1N1機(jī)制，檢測藥物作用病毒感染對(duì)MDCK細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)PI（PI為S期和G2/M期細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的百分比），結(jié)果表明，厚樸酚和厚樸水浸液作用感染細(xì)胞的PI均高于病毒對(duì)照組，說明其抗流感病毒作用可能是通過調(diào)整細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的。

2.1.4 病毒空斑試驗(yàn) 楊子峰等[18]研究來源于板藍(lán)根的成分Clemastanin B抗人和禽類流感病毒的活性，在24孔板接種MDCK細(xì)胞，孵育后用病毒感染，在感染前1 h、與病毒同時(shí)加入或在感染后的特定時(shí)間點(diǎn)加入Clemastanin B，藥物作用后，收集上清，用空斑試驗(yàn)測定感染滴度。結(jié)果表明，病毒感染后加入Clemastanin B處理細(xì)胞，檢測到子代病毒滴度明顯下降，說明Clemastanin B在體外對(duì)流感病毒引起的感染有一定的抑制作用。

2.2 體內(nèi)研究方法

2.2.1 雞胚模型 聶黎行等[19]研究板藍(lán)根中一對(duì)硫代葡萄糖苷異構(gòu)體（表原告依春、原告依春）及其降解產(chǎn)物（表告依春、告依春）抗甲型流感活性及其作用機(jī)制，采用雞胚模型評(píng)估4種化合物在體內(nèi)的抗病毒效力，選用10日齡胚胎接種流感病毒（H1N1），3種方式給藥：（1）先用樣品處理胚胎，孵育后用病毒感染；（2）先接種病毒，孵育后加入樣品作用；（3）先將病毒和樣品作用，孵育后將混合物加入雞胚孵化。充分孵化后，吸取尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)。結(jié)果表明，板藍(lán)根中的4種化合物在雞胚內(nèi)對(duì)甲型H1N1流感病毒沒有預(yù)防或治療作用。但樣品+病毒混合液處理雞胚后發(fā)現(xiàn)，在最低考察濃度（0.625 mg/ml）下，表原告依春、原告依春、表告依春和告依春的抑制率分別為0，100 %，25 %和50 %，抗病毒效力大小順序?yàn)椋涸嬉来海靖嬉来海颈砀嬉来海颈碓嬉来?。張兵等[20]以雞胚為模型，研究白及提取物體外抗流感病毒藥效，選用9日齡SPF級(jí)雞胚，將不同濃度提取液與病毒液混合，接種于雞胚尿囊腔，孵育后，吸取尿囊液，用凝血試驗(yàn)測定血凝效價(jià)，用PCR技術(shù)擴(kuò)增病毒核酸，定量核酸量（Ct值）。結(jié)果表明，白及水提物和醇提物均有一定的抗流感病毒活性。趙炎軍等[21]研究金蕎麥提取物抑制雞胚中流感病毒增殖作用，結(jié)果顯示，金蕎麥提取物中、高濃度均能明顯降低雞胚尿囊液的血凝滴度，提示金蕎麥提取物在體外有明顯的流感病毒抑制作用。Jadhav等[22]研究磷脂酰膽堿（PC）結(jié)合圣羅勒甲醇提取物抗雞胚接種H1N1流感病毒的效力。結(jié)果表明，圣羅勒在實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)H1N1流感病毒無抑制作用。

2.2.2 小鼠/大鼠模型 Chen等[23]使用束縛應(yīng)激小鼠為易感性小鼠模型，流感病毒A/FM/1/47（H1N1）鼠肺適應(yīng)株感染小鼠，評(píng)價(jià)抗病毒口服液（KBD）的抗流感病毒作用。結(jié)果表明，與“束縛應(yīng)激+病毒”組相比，KBD高劑量治療組小鼠的病情較輕，存活率提高35.7 %，平均死亡天數(shù)延長至（19.3±4.4）d。而KBD對(duì)正常小鼠感染后的死亡率和發(fā)病率沒有顯著影響，說明KBD對(duì)易感小鼠抗病毒作用更強(qiáng)。李玲等[24]進(jìn)行抗病毒性肺炎的中藥復(fù)方篩選及作用機(jī)制研究，采用免疫抑制小鼠，用流感病毒A/PR/8/34鼠肺適應(yīng)株感染。各中藥復(fù)方處理小鼠模型，同時(shí)設(shè)置正常小鼠組、肺炎模型組（未用藥物處理）和陽性藥物（奧司他韋）組，篩選出能有效抗流感病毒性肺炎的麻杏石甘湯。進(jìn)一步研究表明，病毒感染后模型組小鼠體重和胸腺指數(shù)明顯下降，肺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯升高，而高、中劑量麻杏石甘湯處理后，小鼠體重、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)上調(diào)，肺指數(shù)下調(diào)，與陽性藥物奧司他韋相當(dāng)。肺組織病理變化表明，模型組肺部炎癥明顯，肺泡結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，而3個(gè)劑量的麻杏石甘湯均能改善肺部炎癥，中、高劑量與陽性藥物奧司他韋作用相當(dāng)，且麻杏石甘湯能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌。提示麻杏石甘湯可能通過提高機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌與表達(dá)，減輕肺部炎癥，改善機(jī)體狀況，起到抗流感病毒性肺炎的作用。程淼等[25]研究板藍(lán)根對(duì)流感病毒鼠肺適應(yīng)株（FM1）所致的肺炎小鼠病理損傷修復(fù)作用，觀察板藍(lán)根對(duì)小鼠氣管、肺組織病理損傷的影響，結(jié)果表明，光鏡下觀察，板藍(lán)根作用后，肺組織病變較模型組同期明顯減輕，逐漸呈恢復(fù)趨勢(shì)；氣管掃描電鏡下觀察到，板藍(lán)根作用后氣管表面形態(tài)學(xué)病變較模型組明顯減輕，說明板藍(lán)根能修復(fù)流感病毒所致肺炎小鼠的肺組織、氣管病理損傷。Fu等[26]研究3種中藥復(fù)方治療流感病毒感染小鼠的免疫學(xué)機(jī)制，用FM1病毒株感染正常小鼠和TLR7基因敲除小鼠，用3種中藥復(fù)方治療。結(jié)果表明，奧司他韋、桂枝麻黃湯和銀翹散對(duì)病毒感染的正常小鼠和TLR7基因敲除小鼠治療效果有顯著差異，提示中藥對(duì)流感病毒感染所致炎癥的治療作用需TLR7信號(hào)的參與。Zhi等[27]研究富含黃酮類化合物的黃芩提取物（FESR）抗甲型流感病毒所致急性肺損傷的作用。采用超高效液相色譜-電噴霧線性離子肼質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-ESILTQ/MS）分析FESR在正常小鼠和H1N1小鼠適應(yīng)株（A/FM/1/47）感染小鼠的體內(nèi)代謝過程，并探討了其代謝活化機(jī)制。結(jié)果表明，代謝產(chǎn)生的反互補(bǔ)苷元可能是FESR治療甲型流感病毒感染的潛在有效物質(zhì)。張世鷹等[28]研究麻黃先煎之麻杏石甘湯的抗流感病毒機(jī)制，大鼠灌胃給予各組藥物，靜脈取血制備含藥血清，含藥血清作用于各組[空白對(duì)照組、Toll樣受體7/8（TLR7/8）激活劑干預(yù)組、TLR7抑制劑干預(yù)組、TLR8抑制劑干預(yù)組、病毒干預(yù)組]A型流感病毒小鼠肺適應(yīng)株（A/PR/8/34）感染的巨噬細(xì)胞，檢測巨噬細(xì)胞TLR7/8介導(dǎo)的α/β干擾素（IFN-α/β）的分泌及蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，麻黃先煎之麻杏石甘湯含藥血清對(duì)其分泌水平與蛋白表達(dá)有顯著的調(diào)控作用，說明這可能是麻杏石甘湯抗流感病毒作用機(jī)制之一。謝惠珺等[29]研究銀翹散體外抗甲型流感病毒的作用，建立了甲型H3N2流感病毒株（A/Aichi/2/68）感染BALB/c小鼠肺炎模型，感染后觀察感染小鼠生存狀態(tài)及檢測肺指數(shù)。結(jié)果表明，銀翹散大劑量可減輕全身癥狀，降低肺指數(shù)，提示銀翹散有體內(nèi)抑制流感病毒H3N2復(fù)制的作用。

2.2.3 樹鼩模型 研究發(fā)現(xiàn)H1N1、H5N1、H9N2和H7N9均能在樹鼩模型上高效復(fù)制，為流感病毒的研究提供了有用的替代模型[30-33]。李際強(qiáng)等[34]以H3N2流感病毒感染樹鼩，建立流感病毒樹鼩模型，研究升降散的抗流感病毒作用。結(jié)果表明，升降散治療的兩只樹嗣的體溫未出現(xiàn)大的明顯的波峰，說明升降散可能在退熱方面有較好的效果。相比于對(duì)照組，升降散組樹鼩病變較輕，僅有肺泡擴(kuò)大，說明升降散可能對(duì)肺部炎癥有改善作用。

2.2.4 臨床試驗(yàn) 臨床試驗(yàn)是檢驗(yàn)藥物作用的金標(biāo)準(zhǔn)，用于中藥在人體內(nèi)抗流感病毒作用的安全性與有效性研究。選擇一定數(shù)量的流感患者，分為治療組和陽性藥物對(duì)照組，觀察治療前后患者臨床癥狀變化，監(jiān)測有無藥物不良反應(yīng)，以此評(píng)價(jià)藥物的治療作用及人體安全性[35-36]。王守軍[37]研究連花清瘟膠囊抗流感病毒藥理機(jī)制，選取100例流感患者，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組（磷酸奧司他韋膠囊），每組50例。結(jié)果表明，治療組治療有效率為98 %，高于對(duì)照組，且治療組退熱時(shí)間、呼吸道癥狀改善時(shí)間、臨床癥狀改善時(shí)間、住院時(shí)間均短于對(duì)照組，說明連花清瘟膠囊治療流感病毒引發(fā)的流行性感冒效果顯著，值得臨床推廣應(yīng)用。Wang等[38]觀察中藥復(fù)方安替威治療流感的臨床療效與安全性，采用隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的方法，選取流感樣病人和流感患者480例，隨機(jī)分配安替威顆粒和安慰劑，觀察疾病的癥狀的嚴(yán)重程度及康復(fù)患者數(shù)量。結(jié)果表明，對(duì)于流感確診患者，與安慰組相比，安替威顆粒的療效顯著提高，患者康復(fù)率更高且顯示出疾病嚴(yán)重程度的減輕（發(fā)燒、咳嗽、咳痰的改善率高于安慰劑組），試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)癥狀，表明安替威顆粒有顯著的臨床抗病毒效果，且總體耐受性良好。

2.3 分析技術(shù)

2.3.1 血凝抑制試驗(yàn) HA是流感病毒表面的重要的糖蛋白，可與宿主細(xì)胞膜的唾液酸結(jié)合，并協(xié)助病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合，在病毒生命周期起著重要作用[39]。不同亞型流感病毒HA與宿主表面的對(duì)應(yīng)受體結(jié)合引起血凝現(xiàn)象。當(dāng)藥物與HA結(jié)合，抑制流感病毒的凝血作用，表現(xiàn)出抗流感病毒活性。血凝抑制試驗(yàn)以流感病毒懸液、藥物和紅細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，向病毒懸液中加入藥物，觀察紅細(xì)胞凝血現(xiàn)象，以紅細(xì)胞凝血程度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，表示藥物抗該亞型流感病毒的活性[40]。楊子峰等[41]采用血凝抑制試驗(yàn)研究板藍(lán)根提取物S-03體外抑制甲、乙型流感病毒感染的活性，結(jié)果表明板藍(lán)根提取物對(duì)不同亞型人流感病毒HA有抑制作用，最低抑制濃度為3.12～25 mg/ml。孫琴等[42]用血凝抑制試驗(yàn)研究板藍(lán)根中fructopyrano-(1→4)-glucopyranose（FG）的體外抗病毒活性。結(jié)果表明，F(xiàn)G對(duì)流感病毒血凝素有明顯的抑制作用，最小抑制濃度為3.1 mg/ml。

2.3.2 NA抑制試驗(yàn) NA是存在于流感病毒表面的另一種關(guān)鍵蛋白質(zhì)，可催化唾液酸水解，協(xié)助成熟流感病毒脫離宿主細(xì)胞，是抗流感病毒藥物作用靶點(diǎn)之一[43-44]。體外NA檢測法是抗流感病毒中藥篩選和活性評(píng)價(jià)的常用方法[45-47]。李寒冰等[48]基于NA抑制試驗(yàn)建立板藍(lán)根品質(zhì)的生物評(píng)價(jià)方法。結(jié)果表明，板藍(lán)根體外抑制NA的IC50為（0.90±0.20）mg/ml（生藥），板藍(lán)根乙醇提取物有明顯的體外抑制NA活性，建立的生物效價(jià)檢測方法可用于板藍(lán)根的品質(zhì)評(píng)價(jià)。

超濾質(zhì)譜技術(shù)是將超濾裝置與質(zhì)譜分析結(jié)合的新方法，可實(shí)現(xiàn)中藥中NA抑制劑的在線高通量篩選。馬麗娜等[49]采用超濾-MS技術(shù)篩選板藍(lán)根中抗流感病毒的活性成分，篩選并鑒定出與NA結(jié)合的成分主要是精氨酸、告依春和腺苷。劉舒等[50]采用超濾質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究復(fù)方板藍(lán)根顆粒劑中黃酮和正丁醇提取物的NA抑制活性，結(jié)果表明，提取物中化合物的代謝物黃酮苷元具有較強(qiáng)的NA結(jié)合活性。張語遲等[51]基于超濾-LC/MS從女貞葉中篩選潛在的NA抑制劑，鑒定了13個(gè)化合物為NA抑制劑。Zhao等[52]采用二維HPLC-超濾-電噴霧電離飛行時(shí)間/質(zhì)譜（ESI-TOF/MS）方法，全面富集、篩選和表征金銀花不同極性組分中NA抑制劑，共鑒定出44個(gè)化合物具有NA抑制活性，該方法為從復(fù)雜的中藥化合物中篩選出微量NA抑制劑提供了參考。

固定化酶技術(shù)通過物理吸附、包埋、交聯(lián)等方法，將酶固定到水不溶性載體上并保持酶活性[53]。NA固定化酶反應(yīng)器與毛細(xì)管或高效液相色譜結(jié)合，將NA固定到毛細(xì)管內(nèi)或者色譜柱內(nèi)[54-55]，包含底物4-甲基香豆素基-α-D-神經(jīng)氨酸（MUNANA）、藥物的反應(yīng)液流經(jīng)固定化酶，通過檢測反應(yīng)產(chǎn)物4-甲基傘形酮（4-MU）含量篩選具有抗NA活性的藥物。如趙海燕等[56]將毛細(xì)管電泳與固定化酶微反應(yīng)器相結(jié)合，從中草藥中篩選出6個(gè)有抑制NA活性的化合物，抑制活性大小順序?yàn)檠a(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚＞補(bǔ)骨脂二氫黃酮＞黃芩素＞黃芩苷＞白楊素＞牡荊素。趙瑜梅等[57]制備了NA微反應(yīng)器，基于LC-MS/MS建立活性評(píng)價(jià)方法，并應(yīng)用于金銀花抗流感病毒活性成分的篩選。經(jīng)NA微反應(yīng)器篩選并進(jìn)行活性測試，木犀草苷、木犀草素、異綠原酸、異綠原酸表現(xiàn)出較好的NA抑制活性。

2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA） 張美義等[58]研究金翹片體內(nèi)抗流感病毒作用機(jī)制，采用雙抗夾心ELISA法檢測流感病毒感染后小鼠肺組織和血清中γ-干擾素（γ-IFN）的水平。結(jié)果表明，金翹片能通過提高感染小鼠γ-IFN水平，發(fā)揮抑制流感病毒作用。王永鋒等[59]研究梔子苷治療流感病毒引起肺損傷的作用機(jī)制。結(jié)果表明，梔子苷作用后IL-6、TNF-α水平顯著降低，低劑量梔子苷作用后IFN-β水平顯著提高，提示梔子苷可能是通過影響TLR3/能誘導(dǎo)產(chǎn)生β干擾素的含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白（TRIF）信號(hào)通路，抑制炎癥因子IL-6、TNF-α的分泌，提高抗病毒生物活性物質(zhì)IFN-β合成，實(shí)現(xiàn)抗流感病毒作用。

2.3.4 免疫組織化學(xué)法（IHC） Zhu等[60]研究魚腥草多糖（HCP）改善流感病毒感染引起的小鼠肺炎和腸道損傷作用機(jī)制，采用IHC檢測感染小鼠肺組織中TLR4和核因子κB-P65（P65 NF-κB）的表達(dá)及小腸部位IgA和緊密連接蛋白（ZO-1）的表達(dá)。結(jié)果表明，HCP通過抑制肺炎性細(xì)胞因子TLR4-NF-κB的表達(dá)，增加腸黏膜IgA和緊密連接蛋白（ZO-1）的表達(dá)，改善受損的免疫屏障和腸道物理屏障，減輕流感病毒所致的肺和腸道病理損傷，提高存活率。

2.3.5 間接免疫熒光法 Li等[61]研究板藍(lán)根中成分lariciresinol-4-O-β-D- glucopyranoside抑制甲型流感病毒誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)作用機(jī)制，采用間接免疫熒光法檢測A549細(xì)胞中甲型流感病毒核蛋白復(fù)合物的核輸出。結(jié)果表明，lariciresinol-4-O-β-D-glucopyranoside并不影響病毒核糖核蛋白復(fù)合物在感染后期從細(xì)胞核輸出。徐詠書等[62]研究3種板藍(lán)根制劑對(duì)流感病毒NP表達(dá)的影響，將板藍(lán)根凝集素作用于轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pc DNA3.1（+）/NP 的Hela細(xì)胞，用膠體金免疫層析法和間接免疫熒光法檢測各組NP表達(dá)。結(jié)果顯示板藍(lán)根凝集素在0.78 mg/ml的實(shí)驗(yàn)濃度下NP 不表達(dá)，提示板藍(lán)根凝集素可抑制流感病毒NP 基因的表達(dá)，阻止NP 的形成，從而發(fā)揮抗流感病毒感染的作用。Hsieh等[63]研究清方排毒散（CFPTS）抑制流感病毒釋放的作用機(jī)制，通過間接免疫熒光法檢測HA的轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果表明，當(dāng)用CFPTS處理流感病毒感染的MDCK細(xì)胞時(shí)，HA的分布呈聚集模式。而在感染病毒的模擬對(duì)照細(xì)胞中，HA呈彌散分布。而M1在CFPTS處理和未處理的細(xì)胞中的分布沒有顯著差異。因此，CFPTS可能通過影響HA的分布，從而阻斷流感病毒的復(fù)制。

2.3.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot） Liang等[64]基于TLR3介導(dǎo)的信號(hào)通路研究黃芪抗流感病毒的作用機(jī)制，采用Western Blot分析受感染的Raw264.7細(xì)胞中TLR3、轉(zhuǎn)化生長因子激酶1（TAK1）、TANK結(jié)合激酶1（TBK1）、干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）、IFN-β的蛋白表達(dá)水平。初步證實(shí)，黃芪可能通過調(diào)節(jié)TLR3-TBK1-IRF3信號(hào)通路和TLR3-TAK1-NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒作用，蛋白表達(dá)的程度受黃芪的濃度影響。提示黃芪抗病毒作用可能是一種多靶點(diǎn)的雙向機(jī)制，且受藥物濃度的影響。Zheng等[65]研究連翹苷A抗甲型流感病毒小鼠肺部視黃酸誘導(dǎo)基因-I 樣受體（RLR）信號(hào)通路的作用機(jī)制，采用Western Blot檢測了視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I（RIG-I）、線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）和NF-κB在肺組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，連翹苷A組的RIG-I、MAVS和NF-κB水平明顯低于病毒對(duì)照組，連翹苷A通過下調(diào)了RLR信號(hào)通路中涉及的蛋白質(zhì)水平發(fā)揮抗流感作用。

2.3.7 分子印跡聚合物 Yang等[66]采用液相色譜柱與奧司他韋（OS）分子印跡聚合物偶聯(lián)篩選中藥抗流感病毒活性成分，以奧司他韋為印跡模板分子，采用OSMIP-LC色譜柱與HPLC系統(tǒng)相結(jié)合，鑒定出有親和力的成分為苦參堿。通過體外細(xì)胞病變效應(yīng)實(shí)驗(yàn)和血凝抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提取物的體外抗病毒活性，并分析抗病毒活性與其在OS-MIPLC柱上的保留時(shí)間之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，苦參堿在OSMIP-LC色譜柱上親和力與OS相近，OS和苦參堿在體外對(duì)H9N2具有減輕CPE和血凝抑制（HI）的活性。由抗病毒活性與色譜保留時(shí)間的相關(guān)性得出結(jié)論，分析物與模板分子之間的色譜行為差異越小，生物活性就越相似。該方法可用于抗流感病毒中藥成分的初步篩選。

2.3.8 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） Chen等[67]研究基于TLR7途徑槲皮素抗H1N1病毒作用機(jī)制，采用RT-PCR檢測TLR7信號(hào)通路TLR7、髓樣分化因子88（MyD88）、白介素-1受體相關(guān)激酶4（IRAK4）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）和NF-kB mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，與病毒對(duì)照組相比，槲皮素和奧司他韋顯著降低H1N1誘導(dǎo)的TLR7、MyD88、IRAK4、TRAF6和NF-kB mRNA的過度表達(dá)，說明槲皮素和奧司他韋的抗病毒機(jī)制與TRL7途徑有關(guān)。Geng等[68]研究葛根湯抗甲型流感病毒感染機(jī)制，采用定量RT-PCR分析病毒上清的病毒基因組拷貝，以確定葛根湯是否影響病毒生物合成的后期階段。結(jié)果表明，感染后10 h，葛根湯治療組的病毒基因組拷貝數(shù)比模型組減少了5倍，說明葛根湯體外抗H1N1病毒活性作用于病毒附著和復(fù)制階段。劉曉婷等[69]采用RTPCR研究黃芩苷對(duì)流感病毒H1N1 感染的A549細(xì)胞中天冬半胱氨酸蛋白酶（caspase）表達(dá)的影響。結(jié)果表明，黃芩苷高劑量組（3.96 mg/L）和低劑量組（0.99 mg/L）caspase-3、caspase-8 mRNA 表達(dá)均明顯下降，caspase-4和蛋白磷酸酶3催化亞基-α-亞型基因（Cn）表達(dá)也明顯下調(diào)。實(shí)驗(yàn)中caspase-9表達(dá)沒有變化，提示黃芩苷作用可能是外源性途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路途徑的凋亡相關(guān)基因表達(dá)。

2.3.9 原子力顯微鏡觀察（AFM） AFM可應(yīng)用于觀察病毒感染前后細(xì)胞和病毒表面形態(tài)的改變、蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，對(duì)病毒感染細(xì)胞后的過程進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，檢測細(xì)胞動(dòng)力學(xué)參數(shù)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過程。AFM可從形態(tài)學(xué)角度研究中藥抗流感病毒的活性與作用機(jī)制。Hsieh等[70]采用AFM研究麻杏石甘湯抑制流感病毒侵入的機(jī)制，結(jié)果表明，麻杏石甘湯破壞了病毒的表面結(jié)構(gòu)而阻斷了病毒的侵入。

3 結(jié)語和展望

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，中藥抗病毒活性與機(jī)制研究已取得了一定的進(jìn)展。其研究方法涉及蛋白質(zhì)/核酸、細(xì)胞/細(xì)胞系、雞胚、整體動(dòng)物、人體水平，涉及細(xì)胞、免疫、動(dòng)物等生物學(xué)技術(shù)和其他新興分析技術(shù)。經(jīng)臨床驗(yàn)證，中藥在流感防治中發(fā)揮著獨(dú)特的作用，如在抗病毒的同時(shí)發(fā)揮抗炎、清熱的作用，縮短發(fā)熱時(shí)間，另可通過免疫調(diào)節(jié)功能，加快機(jī)體恢復(fù)，此外中藥多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)決定了中藥具有廣譜抗病毒活性。因此，中藥在抗流感病毒防治方面具有良好的研究和開發(fā)前景。

中藥抗流感病毒活性和機(jī)制的深入研究需要多學(xué)科間的合作與交流，一方面需要深入的中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究，加快中藥有效成分的發(fā)現(xiàn)、提取、分離等，另一方面需要中藥抗流感病毒活性和機(jī)制研究方法與中藥臨床療效更好地匹配，從而更加深入地闡述中藥抗流感病毒活性成分、作用機(jī)制，為抗流感病毒中藥的發(fā)現(xiàn)與安全、有效的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的依據(jù)。