丁香降氣顆粒的研制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

柴蓉蓉，高佳鶯，潘會君，朱全剛

（上海市皮膚病醫(yī)院 一期臨床試驗中心，上海 200443）

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是一種常見的消化道動力障礙性疾病，由于胃腔和食管過度接觸胃液而引起臨床胃食管反流癥和食管黏膜損傷，患者主要表現(xiàn)為反酸、燒心、胸骨后疼痛等[1-4]。目前臨床常用質(zhì)子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）治療GERD，PPI可高效快速抑制胃酸分泌，但沒有從根本解決反流癥狀，復(fù)發(fā)率高，需要長期維持治療。丁香降氣方是治療胃食管反流病的經(jīng)驗方，由丁香、焦山梔、枳殼、柴胡等10味藥材組成，采用疏肝和胃法治療胃食管反流病患者有良好的效果。但在臨床上患者常用湯劑，服藥不便。顆粒劑具有服藥方便、便于攜帶及儲藏等優(yōu)點(diǎn)，所以本研究將丁香降氣方制成丁香降氣顆粒，對其提取和制劑工藝進(jìn)行優(yōu)化，并制定了嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可用于丁香降氣顆粒的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；ODS C18柱（日本島津公司）；ZORBAX SB C18柱（美國安捷倫公司）；ES225SM-DR十萬分之一電子分析天平（瑞士賽普利斯）；萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯；CQ-250-DST型超聲波清洗儀（上海躍進(jìn)）；DHG-9071型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海浦東榮豐）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏）；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（雅萊）；XMTE-8112型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏）；WFH-203B型三用紫外分析儀（上海馳唐）。

1.2 試藥

炒枳殼，焦梔子，北柴胡，姜汁黃連，黃精，吳茱萸，金沸草，丁香，厚樸，煅瓦楞子，均購自上海虹橋中藥飲片有限公司，經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院藥劑科潘會君博士鑒定符合藥典標(biāo)準(zhǔn)；柚皮苷對照品（批號：14072545，純度為98 %），梔子苷對照品（批號：110749-201115，純度為98 %），鹽酸小檗堿，厚樸酚，和厚樸酚，黃精對照藥材，均購自中國食品藥品檢定研究院；糊精，一水乳糖（上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司）；丁香降氣顆粒（自制，批號：15021301，15021302，15021303）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 柚皮苷測定色譜條件 色譜柱：ODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-1 %磷酸（22:78）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：283 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.1.2 梔子苷測定色譜條件 色譜柱：ZORBA SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（25:75）；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：238 nm；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷對照品3.12 mg，梔子苷對照品3.05 mg，分別置于10 ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為312 μg/ml的柚皮苷對照品溶液和濃度為305 μg/ml的梔子苷對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取丁香降氣顆粒約0.15 g，精密稱定于20 ml量瓶中，加甲醇適量，在20 Hz、500 W條件下超聲20 min后放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液制成供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方量比例取缺枳殼或焦梔子的其余藥材飲片，參照丁香降氣顆粒制備工藝方法制成缺枳殼陰性樣品和缺焦梔子陰性樣品，按2.2.2項方法制備成缺枳殼陰性樣品溶液和缺焦梔子陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 取2.2項下柚皮苷、梔子苷對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按2.1項色譜條件進(jìn)樣，缺枳殼陰性樣品在與柚皮苷對照品峰相同的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明丁香降氣顆粒中其他成分不干擾柚皮苷的測定。柚皮苷陰性樣品、對照品與丁香降氣顆粒供試品的色譜圖見圖1。缺焦梔子陰性樣品在與梔子苷對照品峰相同的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明丁香降氣顆粒中其他成分不干擾梔子苷的測定。梔子苷陰性樣品、對照品與丁香降氣顆粒供試品的色譜圖見圖2。

圖1 柚皮苷專屬性考察HPLC圖譜

圖2 梔子苷專屬性考察HPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 將312 μg/ml柚皮苷對照品溶液配制成濃度為156.00，78.00，39.00，19.50，9.75 μg/ml的溶液；將305.00 μg/ml梔子苷對照品溶液配制成濃度為152.50，76.25，38.13，19.06，9.53 μg/ml的溶液。按2.1項色譜條件測定，記錄峰面積，以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得柚皮苷回歸方程為Y=11.675X+10.16（r=1.0000），即柚皮苷在9.75～156.00 μg/ml內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；梔子苷回歸方程為Y=13.245X+16.092（r=0.9999），即梔子苷在9.53～152.50 μg/ml內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.3 日內(nèi)精密度實驗 分別吸取高、中、低3種濃度的柚皮苷對照品溶液（濃度分別為312，78.00，9.75 μg/ml）和高、中、低3種濃度的梔子苷對照品溶液（濃度分別為152.50，76.25，9.53 μg/ml），按2.1項色譜條件，連續(xù)測定5次，高、中、低濃度的柚皮苷對照品溶液的峰面積RSD分別為0.95 %，0.45 %，0.57 %，高、中、低濃度的梔子苷對照品溶液的峰面積RSD分別為1.21 %，1.26 %，0.88 %，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 日間精密度實驗 分別吸取高、中、低3種濃度的柚皮苷對照品溶液（濃度分別為312，78.00，9.75 μg/ml）和高、中、低3種濃度的梔子苷對照品溶液（濃度分別為152.50，76.25，9.53 μg/ml），按2.1項色譜條件，每天進(jìn)樣一次，連續(xù)測定5 d，高、中、低濃度的柚皮苷對照品溶液的峰面積RSD分別為1.98 %，1.63 %，2.50 %，高、中、低濃度的梔子苷對照品溶液的峰面積RSD分別為0.93 %，0.94 %，1.63 %，結(jié)果表明對照品溶液5 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取丁香降氣顆粒約0.15 g，精密稱定，按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件，分別于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣，測得梔子苷、柚皮苷峰面積的RSD值分別為0.38 %和0.21 %，結(jié)果表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性實驗 取丁香降氣顆粒6份，每份約0.15 g，精密稱定，按2.2.2項方法平行制備供試品溶液，按2.1項色譜條件進(jìn)樣測定，測得柚皮苷、梔子苷的平均含量分別為1.50，1.21 mg，RSD分別為2.05 %和1.98 %。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率實驗 取丁香降氣顆粒約0.04 g，精密稱定于10 ml量瓶中，平行9份，分別加入約相當(dāng)于樣品中柚皮苷和梔子苷含量的 80 %，100 %，120 % 的對照品溶液適量，各平行3份；按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件進(jìn)樣測定，測得柚皮苷、梔子苷的平均回收率分別為96.54 %，103.62 %，RSD分別為0.16 %，0.44 %。

2.4 提取正交試驗

選擇加水量（A）、煎煮時間（B）、提取次數(shù)（C）為因素，平行操作下，按L9（34）正交設(shè)計進(jìn)行試驗，以浸膏得率和柚皮苷、梔子苷含量為考察指標(biāo)，計算綜合評分，權(quán)重為干浸膏得率40 %、柚皮苷40 %、梔子苷20 %，并對結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析。由表1可得出9次實驗的綜合評分。由表2可知：影響丁香降氣顆粒水提工藝的因素順序為C（提取次數(shù)）＞A（加水量）＞B（提取時間），因素A以2水平時最佳，因素B以2或3水平時最佳，因素C以3水平時最佳；因素C對實驗結(jié)果有顯著影響，因素A、B對實驗結(jié)果均無顯著影響。由此得到最佳組合為A2B3C3或A2B2C3。隨著加水量的增加，浸膏得率和指標(biāo)成分的含量也會增加，但在加水量為10倍后，增加的量可以忽略不計，考慮到節(jié)約能源，降低生產(chǎn)成本，采用提取工藝為A2B2C3，即加水量10倍，煎煮時間1.0 h，提取次數(shù)3次。

2.5 輔料篩選

2.5.1 輔料種類篩選 分別將糊精、乳糖與干燥浸膏粉按輔料:浸膏粉比例1:1混合，選用95 %乙醇作為潤濕劑，制備顆粒，以顆粒的成型率、溶化性、成本價和制粒難易度為評價指標(biāo)篩選輔料。結(jié)果表明，糊精的成型率、制粒難易度明顯優(yōu)于乳糖；乳糖溶化性較好，但吸濕后容易液化，使顆粒黏連，顏色變深，且乳糖的價格較高，所以選擇糊精作為輔料。

2.5.2 輔料用量篩選 將輔料與浸膏粉分別按1:1，2:3，1:2不同比例混合制粒，在顆粒能成型的條件下，按輔料最少原則確定輔料與浸膏粉比例。選用95 %乙醇作為潤濕劑制備顆粒。當(dāng)糊精與浸膏粉比例為1:2時即可制成顆粒，本著輔料用量最小的原則，確定輔料與浸膏粉比例為1:2。

表1 正交試驗結(jié)果

表2 丁香降氣顆粒提取工藝正交試驗直觀分析表

2.5.3 潤濕劑濃度及用量篩選 將輔料與浸膏粉按1:2的比例混合，分別加入濃度為50 %，75 %，80 %，95 %的乙醇，用量為浸膏與輔料混合粉末總量的2 %，5 %，8 %，制備顆粒。以成型率為評價指標(biāo)，優(yōu)選最佳制劑工藝條件。由實驗結(jié)果可知，顆粒劑的得率隨乙醇用量的增加而增加；乙醇濃度為95 %時，得率最高，但考慮到成本及乙醇濃度高容易產(chǎn)生安全問題，選用80 %的乙醇作為潤濕劑，用量為混合粉末總量的8 %。

2.6 丁香降氣顆粒的制備方法

將干浸膏打粉，過80目篩，加入輔料后混合均勻，噴以75 %乙醇作為潤濕劑，攪拌到手捏成團(tuán)，觸之即散時，搖擺制粒機(jī)制粒，65 ℃干燥2 h，過四號篩整粒后即得。以優(yōu)化所得工藝條件進(jìn)行3次驗證實驗，考察丁香降氣顆粒的成型率、溶化性和制粒難易度。丁香降氣顆粒的成型率、溶化性和制粒難易度均較好，說明制劑工藝實驗得到的工藝條件切實可行。

2.7 薄層色譜鑒別

按照中國藥典2015年版四部中的薄層鑒別方法[5]對丁香降氣顆粒中的枳殼、焦梔子、姜汁黃連、厚樸和黃精進(jìn)行鑒別。

2.7.1 枳殼薄層鑒別 稱取丁香降氣顆粒樣品（批號：15021301，15021302，15021303）2.00 g，加甲醇10 ml，超聲30 min，取續(xù)濾液，制成供試品溶液備用。稱取枳殼對照藥材粉末0.40 g，參考供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。稱取柚皮苷對照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方量比例取缺枳殼的其余藥材飲片，參照丁香降氣顆粒制備工藝方法制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015版附錄）實驗，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液及對照藥材溶液各1 μl、對照品溶液5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:6:2）下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3 %三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱約5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.7.2 焦梔子薄層鑒別 稱取丁香降氣顆粒樣品（批號：15021301，15021302，15021303）2.00 g，加乙醇10 ml，超聲20 min，取續(xù)濾液，制成供試品溶液備用。稱取梔子對照藥材粉末1.00 g，參考供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。稱取梔子苷對照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方量比例取缺焦梔子的其余藥材飲片，參照丁香降氣顆粒制備工藝方法制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015版附錄）實驗，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液及對照藥材溶液各8 μl、對照品溶液5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100:10:5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

2.7.3 姜汁黃連薄層鑒別 稱取丁香降氣顆粒樣品（批號：15021301，15021302，15021303）5.00 g，加甲醇25 ml，超聲30 min，取續(xù)濾液，制成供試品溶液備用。稱取黃連對照藥材粉末0.25 g，參考供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。稱取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方量比例取缺姜汁黃連的其余藥材飲片，參照丁香降氣顆粒制備工藝方法制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015版附錄）實驗，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液及對照藥材溶液、對照品溶液各1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3:3.5:1:1.5:0.5:1）為展開劑，濃氨試液預(yù)飽和20 min，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.7.4 厚樸薄層鑒別 稱取丁香降氣顆粒樣品（批號：15021301，15021302，15021303）2.00 g，加甲醇10 ml，超聲30 min，取續(xù)濾液，制成供試品溶液備用。稱取厚樸對照藥材粉末1.00 g，參考供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。稱取厚樸酚、和厚樸酚對照品， 加甲醇分別制成每1 ml含0.5 mg對照品的溶液。按處方量比例取缺厚樸的其余藥材飲片，參照丁香降氣顆粒制備工藝方法制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015版附錄）實驗，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液及對照藥材溶液各8 μl、厚樸酚、和厚樸酚對照品溶液各1 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以甲苯-甲醇（17:1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。

2.7.5 黃精薄層鑒別 稱取丁香降氣顆粒樣品（批號：15021301，15021302，15021303）2.40 g，加70 %甲醇20 ml，加熱回流1 h，抽濾，濾液蒸干，殘渣加水10 ml使溶解，加正丁醇振搖提取2次，每次20 ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。稱取黃精對照藥材粉末1.00 g，參考供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按處方量比例取缺黃精的其余藥材飲片，參照丁香降氣顆粒制備工藝方法制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制備陰性樣品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015版附錄）實驗，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液及對照藥材溶液各8 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（5:2:0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5 ℃香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

圖3 A～E分別為枳殼、焦梔子、姜汁黃連、厚樸、黃精的薄層鑒別結(jié)果。以上供試品薄層色譜中，在與對照藥材及對照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性樣品未見干擾。

圖3 各成分薄層鑒別結(jié)果

2.8 指標(biāo)性成分含量測定

取3批丁香降氣顆粒樣品（批號：15021301，15021302，15021303），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，每個批號平行操作3次，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄柚皮苷、梔子苷的峰面積，計算柚皮苷和梔子苷的濃度，結(jié)果見表3。由表3可知，丁香降氣顆粒每克中含柚皮苷應(yīng)不少于9.50 mg，每克中含梔子苷應(yīng)不少于7.00 mg。

2.9 顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定

照中國藥典2015年版四部中顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，對丁香降氣顆粒的粒度、堆密度、休止角、水分、溶解性和裝量差異進(jìn)行測定。丁香降氣顆粒3個批次的粒度差異較小，各自的粒度均不小于85.0 %，休止角應(yīng)小于0.4480，堆密度應(yīng)在0.4445～0.5735之間，各批次顆粒的水分都小于6 %，3個批號顆粒均全部溶解，且杯底無渾濁，沒有發(fā)現(xiàn)異物和焦屑，表明該顆粒的溶解性良好，檢查的10袋供試品裝量差異均在藥典規(guī)定范圍之內(nèi)，且無一袋超出±5 %范圍。丁香降氣顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合藥典要求。

表3 不同批號樣品測定結(jié)果

3 討論

初步藥效學(xué)研究表明，丁香降氣方能改善反流性食管炎大鼠食管黏膜的病理狀況，其作用機(jī)制可能與下調(diào)模型大鼠食管黏膜炎性細(xì)胞因子白介素8（IL-8）、IL-23、IL-17的表達(dá)、減輕食管炎癥有關(guān)[6-7]；還能通過增加胃體和胃竇平滑肌內(nèi)的免疫活性細(xì)胞（ICC）數(shù)量，促進(jìn)胃排空，改善胃動力，治療胃食管反流病。

丁香降氣顆粒提取工藝采用水提法，可保證丁香降氣顆粒與臨床湯劑藥效基本一致。該制劑由十味中藥組成，丁香在處方中用量小，且丁香酚疏肝和胃效果不明顯，故不將其作為指標(biāo)性成分。柚皮苷具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，同時可抑制脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子（TNF）釋放所造成的肝損害[8]；梔子苷具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝利膽作用[9]，對治療胃食管反流病能起到關(guān)鍵效果，因此本制劑選用梔子苷和柚皮苷為指標(biāo)性成分。由于丁香降氣方中不含堅硬的動植物藥材及含淀粉、蛋白質(zhì)較多的藥材，故浸泡時間的長短對有效成分影響不大，所以不將煎煮時間作為因素之一，所有藥材飲片統(tǒng)一浸泡20 min。

由于胃食管反流病臨床治療周期較長，患者需長期服藥；且該處方藥量大，藥物提取物含量較高，不適于制成片劑和膠囊；而顆粒劑既保持了湯劑吸收快、顯效迅速的特點(diǎn)，又克服了湯劑需服用前臨時煎煮、久置易霉變、攜帶不便的缺點(diǎn)；顆粒劑易溶解、易吸收，生物利用度優(yōu)于片劑，且制備工藝比片劑、膠囊簡單，故將丁香降氣方制成顆粒劑?？紤]到老年患者及糖尿病患者服用，擬采用無糖型顆粒劑[10]。本研究優(yōu)化了丁香降氣顆粒的提取和制劑工藝，建立了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為丁香降氣顆粒的生產(chǎn)提供了依據(jù)。