超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜肉中阿托品

杜國輝，姜冬峰，張應(yīng)龍

（山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250103）

阿托品是抗膽堿藥，為從茄科植物顛茄、曼陀羅或莨菪等提取的消旋莨菪堿，為M-受體阻斷劑。其堿酸鹽為無色結(jié)晶或白色粉末，易溶于水。阿托品有抑制腺體分泌、抗休克、解除平滑肌痙攣、解毒、興奮呼吸中樞等多重藥理作用[1]。在監(jiān)督執(zhí)法的案例中發(fā)現(xiàn)有違法分子對待宰牲畜注射腎上腺素、阿托品等違禁藥物，被注射后的牲畜藥性發(fā)作后處于極渴狀態(tài)，大量超負(fù)荷飲水。而這些違禁藥物進(jìn)入人體后，可能導(dǎo)致中毒。

目前阿托品檢測方法主要有放射受體檢測法[2]、高效液相色譜法（HPLC）[3]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[4-5]、氣相色譜法[6]、毛細(xì)管電泳法[7]等。在所有的這些方法中，HPLC-MS/MS不僅使阿托品殘留的鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確，同時提升檢測靈敏性。

本文建立了測定豬肉、牛肉、羊肉等常見畜肉中阿托品的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）法。具有簡單、快速、高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于檢測市場上注水肉，有效保障食品安全。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子分析天平，精準(zhǔn)度為十萬分之一（德國Sartorius公司）；Milli-Q型純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；勻漿機(jī)（德國IKA公司）；固相萃取儀（美國Waters公司）；渦旋振蕩混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造公司）；離心機(jī)（德國Sartorius公司）；Waters XEVO TQS超高效液相色譜儀-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）。

1.2 材料與試劑

自制Milli-Q超純水（實驗室制備）；阿托品對照品（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（美國Meck公司）。Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（美國Waters公司，規(guī)格為200 mg，6 ml）；0.2 μm微孔濾膜（Agilent 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器條件

2.1.1 色譜條件 流動相：A：0.1 %甲酸乙腈，B：0.1 %甲酸水，梯度洗脫；流速0.3 ml/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μl；色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.1.2 質(zhì)譜條件 多反應(yīng)監(jiān)測模式，碰撞氣流量為0.20 ml/min；脫溶劑氣流量為1000 L/h；脫溶劑溫度為500 ℃：離子源溫度為150 ℃；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；電離模式為ESI正離子模式；其他參數(shù)見表2。

表2 阿托品LC-MS/MS MRM參數(shù)一覽表

2.2 溶液的制備

2.2.1 阿托品校準(zhǔn)液制備 精密量取阿托品對照品溶液適量，加空白基質(zhì)溶液稀釋成濃度約50 ng/ml的溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 取樣品約2 g，精密稱定，置入50 ml離心管，加入25 ml提取液（乙腈和水體積比為8:2），充分混勻。超聲提取20 min，10 000 r/min離心5 min，棄去沉淀，取8 ml上清置入10 ml玻璃試管，緩慢裝入PRiME HLB，緩?fù)苾艋?dāng)液體離開凈化層之后，吸取凈化層上的液體，體積為2 ml，50 ℃下氮?dú)獯蹈桑? %甲酸乙腈0.5 ml溶解殘渣，0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)樣測定。

2.2.3 空白基質(zhì)溶液制備 根據(jù)2.2.2供試品溶液制備項方法進(jìn)行配制，樣本改為不含阿托品的豬肉樣本?？瞻谆|(zhì)溶液、供試品溶液的總離子流圖見圖1。

圖1 空白基質(zhì)溶液、供試品溶液的總離子流圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限 分別用豬肉、牛肉、羊肉3種空白基質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。由表3可見，阿托品在一定范圍線性關(guān)系較好，其相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.99以上。羊肉、牛肉、豬肉中阿托品藥物的定量限為0.5 μg/kg，其信噪比（S/N）均滿足≥10的要求。

表3 不同基質(zhì)中阿托品藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限

2.3.2 回收率及精密度 分別選取豬肉、牛肉、羊肉3大類基質(zhì)進(jìn)行試驗，每類基質(zhì)中選取相應(yīng)的代表樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。豬肉、牛肉、羊肉阿托品的添加量分別為0.5，5，10 μg/kg，并進(jìn)行6次平行實驗。為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，以相應(yīng)類別的空白樣品基質(zhì)配置的標(biāo)準(zhǔn)溶液所得標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，結(jié)果見表4。

表4 回收率與RSD測定結(jié)果

由結(jié)果可見，阿托品的回收率達(dá)82.6 %～102.8 %，RSD均10 %，表明該方法對測定豬肉、牛肉、羊肉中阿托品的殘留量均具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

3 討論

3.1 流動相的選擇

分別對乙酸銨、甲酸水、水和乙腈、甲醇形成的流動相系統(tǒng)的洗脫效果進(jìn)行對比和分析，通過對比峰形對稱性和洗脫效果發(fā)現(xiàn)，流動相使用0.1 %甲酸水溶液和0.1 %甲酸乙腈有較好的洗脫效果，通過優(yōu)化條件，可提升檢測效率，同時避免基質(zhì)對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

3.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

較多質(zhì)譜因素會影響檢測物質(zhì)裂解，如碰撞、電壓等，通過使用阿托品校準(zhǔn)液優(yōu)化質(zhì)譜條件，可優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，確認(rèn)待測物質(zhì)的一級準(zhǔn)確離子峰；可對碎片離子的相對響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行觀察，從而確定適宜的碰撞能量，并最終確定最適定量離子、碎裂電壓等。

3.3 前處理方法的選擇

分別采用HLB柱、MCX柱、PRiME HLB柱考察目標(biāo)分析物。通過調(diào)節(jié)提取液pH值，目標(biāo)化合物在HLB柱、MCX柱上也可獲得較好的回收率，但PRiME HLB柱無需任何活化和平衡，凈化過程相對簡單、快速、省時，且能有效去除畜肉中脂類和蛋白質(zhì)等基質(zhì)干擾物[8]，因此選擇PRiME HLB柱對目標(biāo)分析物進(jìn)行凈化。

4 結(jié)論

本文通過UPLC-MS/MS，建立了一種可以對肉質(zhì)樣本中殘留阿托品量進(jìn)行檢測的方法，該方法操作簡單，通過優(yōu)化處理條件，可使前處理過程更加簡便。此外，該方法具有合理的線性范圍和較高的回收率，分析時間較短，適宜快速檢測，對市場上注水肉的監(jiān)管具有一定的積極作用。