對照品替代法用于綠原酸含量測定的研究

羅華玲，林海霞

（樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山 614000）

綠原酸的藥用歷史悠久，有抗氧化、抗菌、抗病毒、降糖、降脂、降血壓和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[1-3]。綠原酸主要存在于石韋、金銀花、菊花、杜仲葉等[4-6]藥材中，也是某些中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，如小兒咽扁顆粒[7]等。綠原酸分子結(jié)構(gòu)中含酯鍵、不飽和鍵及多元酚，使綠原酸水溶液易受熱和光照而發(fā)生水解和氧化反應(yīng)[8-12]。上述藥品的含量測定項用高效液相色譜（HPLC）-外標(biāo)法測定綠原酸，但單支綠原酸對照品為20 mg，價格昂貴，且其化學(xué)性質(zhì)極不穩(wěn)定，無法長期保存，測定時需臨用新配。對照品替代法是現(xiàn)代分析技術(shù)中的一種新思路和新方法[13-16]。本文在參閱上述文獻(xiàn)及對照品替代法測定藥物含量報道的基礎(chǔ)上，設(shè)計了以價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定的對乙酰氨基酚作為對照品替代，旨在解決對照物質(zhì)獲得困難、成本高和保管困難等問題。本文以兩組分色譜峰相對保留時間為主、對乙酰氨基酚和綠原酸色譜峰紫外光譜為輔進(jìn)行定性，利用測得的相對校正因子計算各供試品中綠原酸的含量，并將測定結(jié)果與《中國藥典》2015年版一部收載外標(biāo)法測定結(jié)果進(jìn)行比較。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（G4212B二極管陣列檢測器、G1311C四元泵、G1316A柱溫箱、G1329B自動進(jìn)樣器、OpenLAB CDS工作站，美國安捷倫公司）；PE-A10高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器，珀金埃爾默公司）；Agilent 1290高效液相色譜儀（G4212A二極管陣列檢測器、G4204A四元泵、G1316C柱溫箱、G4226A自動進(jìn)樣器、OpenLAB CDS工作站，美國安捷倫公司）；XSE205 DualRange電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；CQ-100B超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

1.2 試藥

對乙酰氨基酚對照品（100018-201610，99.9 %），綠原酸對照品（110753-201817，96.8 %），阿魏酸對照品（110773-201614，99.0 %），甘氨酸對照品（140689-201605，100 %），精氨酸對照品（140685-201707，99.9 %）均購自中國食品藥品檢定研究院；石韋（市售飲片，四川某藥業(yè)有限公司，批號180801，170901，180901，180201；四川某制藥有限公司，批號1805303，1705005），小兒咽扁顆粒（市售，蘭州某股份有限公司、黑龍江某制藥有限公司，批號分別為20180922，181005），金銀花（市售飲片，四川某中藥有限公司，批號180301，180501；樂山某藥業(yè)有限公司，批號180301），菊花（市售飲片，成都某藥業(yè)有限公司，批號180501）；乙腈為色譜純，試驗用水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜儀：PE-A10高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器；色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，8 % A；9～15 min，8 %→30 % A；16～24 min，30 % A；24～30 min，30 %→ 8 % A）；檢測波長240 nm；流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。在上述色譜條件下理論板數(shù)分別以綠原酸和對乙酰氨基酚計，均不低于5000，相鄰峰之間分離度均大于1.5。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取綠原酸對照品10.60 mg，置入10 ml量瓶，用50 %甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為綠原酸對照品貯備溶液；精密稱取對乙酰氨基酚對照品10.73 mg，置入10 ml量瓶，用50 %甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對乙酰氨基酚對照品貯備溶液。分別精密量取綠原酸及對乙酰氨基酚對照品貯備液各0.5，1，2，5，10 ml，置入100 ml量瓶，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得線性系列混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的配制

（1）分別取石韋粉末（過二號篩）約0.2 g，精密稱定，置入25 ml量瓶，再精密加入對乙酰氨基酚對照品貯備溶液0.5 ml，加入50 %甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）45 min，放冷，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（2）分別取金銀花粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置入50 ml量瓶，再精密加入對乙酰氨基酚對照品貯備溶液3 ml，加入50 %甲醇適量，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，放冷，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

（3）取菊花粉末（過一號篩）約0.25 g，精密稱定，置入25 ml量瓶，再精密加入對乙酰氨基酚對照品貯備溶液 1 ml，加入70 %甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）40 min，放冷，用70 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（4）取小兒咽扁顆粒的內(nèi)容物，混勻，取適量，研細(xì)，取約l g，精密稱定，置入50 ml量瓶，再精密加入對乙酰氨基酚對照品貯備溶液0.5 ml，加入50 %甲醇適量，超聲處理（功率 250 W，頻率25 kHZ）30 min，放冷，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品替代法方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 按2.1項色譜條件測定，對乙酰氨基酚和綠原酸的理論板數(shù)均大于5000，綠原酸色譜峰峰形良好，供試品溶液色譜中綠原酸與相鄰峰的分離度均大于1.5。對乙酰氨基酚對照品、綠原酸對照品、阿魏酸對照品、甘氨酸對照品、精氨酸對照品液相色譜圖見圖1；混合對照品溶液及各供試品溶液（小兒咽扁顆粒、菊花、金銀花、石韋）液相色譜圖見圖2。該條件下阿魏酸、甘氨酸、精氨酸保留時間為17.094，15.723，8.114 min，由圖2可見，這幾處時間點均有雜質(zhì)峰干擾，無法測定，因此選擇對乙酰氨基酚作為替代對照品。

圖1 對照品HPLC圖譜

圖2 混合對照品及供試品HPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項下線性系列溶液，照2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。分別得綠原酸回歸方程：Y=70 139X-29 383（r=1），線性范圍5.13～102.60 μg/ml；對乙酰氨其酚回歸方程：Y=35 654X-13 805（r=0.9999），線性范圍5.36～107.19 μg/ml，表明兩組分線性關(guān)系良好。

2.3.3 相對校正因子f的計算 采用斜率比值法，以2.3.2項峰面積（Y）與對照品濃度（X，μg/ml）進(jìn)行線性回歸，分別測定綠原酸和對乙酰氨基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距校正為0后（Y=66 071X，Y=33 825X），兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值的倒數(shù)即為相對校正因子f，計算結(jié)果為0.5119。由此，對照品替代法測定樣品溶液中綠原酸濃度的計算公式為：Cm=f×Am×Cs/As。式中，Cm、Am分別為綠原酸濃度和面積，Cs、As分別為對乙酰氨基酚濃度和峰面積。

2.3.4 精密度試驗 精密取2.2.1項下對照品溶液，照2.1項色譜條件進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計算RSD，結(jié)果綠原酸與對乙酰氨基酚色譜峰峰面積平均值（n=6）分別為6 776 310，3 727 016，RSD（n=6）分別為0.24 %和0.29 %。表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取石韋粉末，照2.2.2項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別于配制后放置入0，2，4，8，12，24 h，照2.1項色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，計算得到24 h內(nèi)綠原酸色譜峰峰面積分別為630 897，631 054，629 750，628 345，627 121，625 848，RSD（n=6）為0.33 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

死不認(rèn)賬，是吧？你知道這張照片是誰給我的嗎？是王鯰魚。他已經(jīng)把我給甩了，是老梅毀了我的幸福。王鯰魚還知道你是老梅的鴨子。老梅每個月給你兩千塊錢，對不對？

2.3.6 重復(fù)性 取石韋粉末，照2.2.2項下供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，照2.1項色譜條件進(jìn)樣分析，以對照品替代法計算6份供試品溶液中綠原酸的平均含量（n=6）為0.116 %，RSD（n=6）為0.7 %，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 準(zhǔn)確度 取石韋粉末（過二號篩）約0.2 g，精密稱定，置入25 ml量瓶，分別精密加入對乙酰氨基酚對照品貯備液（107.19 μg/ml）2 ml和綠原酸對照品貯備溶液（102.60 μg/ml）2 ml，加入50 %甲醇適量，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）45 min，放冷，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，平行制備6份，照2.1項色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，分別按對照品外標(biāo)法和對照品替代法計算回收率和RSD，結(jié)果平均回收率分別為98.33 %和98.65 %（n=6），RSD為1.34 %和1.30 %。結(jié)果見表1。

2.4 相對校正因子的耐用性考察

表1 綠原酸回收率測定結(jié)果（n=6）

表2 不同儀器及不同品牌色譜柱測得的相對校正因子

2.4.1 不同儀器及不同品牌色譜柱的考察 實驗分別考察采用PE-A10高效液相色譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 1290高效液相色譜儀，分別用Kromail 100-5-C18（250 mm×4.0 mm，5 μm，1號柱）、Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm，2號柱）、Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，3號柱）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，4號柱） 共4根色譜柱，測定對乙酰氨基酚對綠原酸的相對校正因子f，結(jié)果表明，不同儀器及不同色譜柱對相對校正因子的影響不顯著，表明相對校正因子在不同儀器及不同品牌色譜柱下有好的耐用性。結(jié)果見表2。

2.4.2 不同流速對相對校正因子的影響 照2.1項色譜條件進(jìn)樣分析，考察流速為0.8，1.0，1.2 ml/min的相對校正因子，結(jié)果分別為0.5118，0.5241，0.5128，RSD（n=3）為1.32 %，表明相對校正因子在一定的流速范圍內(nèi)有良好的適用性。

2.4.3 不同柱溫對相對校正因子的影響 照2.1項色譜條件進(jìn)樣分析，考察柱溫為25，30，35 ℃的相對校正因子，結(jié)果分別為0.5128，0.5189，0.5035，RSD（n=3）為1.52 %，表明相對校正因子在適宜的柱溫范圍內(nèi)有良好的適用性。

2.4.4 不同測定波長對相對校正因子的影響 照2.1項色譜條件進(jìn)樣分析，考察測定波長為236，240，244 nm的相對校正因子，結(jié)果分別為0.5087，0.5201，0.5104，RSD（n=3）為1.20 %，表明在同一臺液相色譜儀上，測定波長變化4 nm，對f值影響不大。

2.5 對照品替代法法待測成分色譜峰的定位

2.6 對乙酰氨基酚對照品穩(wěn)定性試驗

將2.2.1項下對照品貯備溶液于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h后，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積，色譜峰面積RSD為0.56 %，表明對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 含量測定

分別收集4個品種共12批次樣品，按2.2.2項方法制備供試品溶液，照2.1項色譜條件下進(jìn)樣測定，分別用對照品外標(biāo)法和對照品替代法計算12批樣品綠原酸含量，并將兩結(jié)果進(jìn)行比較，驗證替代對照法計算含量的準(zhǔn)確性，結(jié)果見表4。由表4可見，2種方法測定的結(jié)果無顯著性差異，表明以對乙酰氨基酚為對照品替代可用于石韋、金銀花、菊花、小兒咽扁顆粒中綠原酸含量的測定。

3 討論

3.1 對照品替代法的選擇

本實驗分別考察了對乙酰氨基酚、阿魏酸、甘氨酸、精氨酸與綠原酸的色譜保留時間及分離情況。各供試品在阿魏酸、甘氨酸、精氨酸保留時間點均出現(xiàn)干擾峰，所以選擇對乙酰氨基酚作為綠原酸含量測定的對照品替代。

表4 樣品含量測定結(jié)果（n=6）

3.2 測定波長的選擇

根據(jù)綠原酸和對乙酰氨基酚對照品的紫外光譜圖，見圖3?？梢娋G原酸在240 nm、326 nm波長處有吸收峰；對乙酰氨基酚在244 nm波長處有吸收峰。在326 nm波長處測定的相對校正因子為0.1429；在240 nm波長處測定值為0.5119，根據(jù)中藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)替代測定法技術(shù)指導(dǎo)原則，相對校正因子應(yīng)接近1，一般不超過0.2～5[13]，因此本實驗選定測定波長為240 nm。

圖3 綠原酸和對乙酰氨基酚紫外光譜圖

3.3 色譜峰的定性

本文使用以兩組分色譜峰相對保留時間為主、對乙酰氨基酚和綠原酸色譜峰紫外光譜為輔的定性方法，通過計算乙酰氨基酚和綠原酸的相對保留時間，預(yù)確定待測成分的位置；再通過比對待測成分與標(biāo)準(zhǔn)光譜圖的一致性進(jìn)行輔助定位，提高待測成分色譜峰定位的準(zhǔn)確度。

3.4 綠原酸溶液的穩(wěn)定性

綠原酸對照品大多以50 %甲醇配制，并置棕色量瓶中避光保存，即使如此，本實驗仍發(fā)現(xiàn)，當(dāng)綠原酸溶液存儲一周后，其峰面積下降約1 %；存儲一個月后，其峰面積下降約20 %，液相色譜圖可見綠原酸峰旁有較大的降解雜質(zhì)峰。文獻(xiàn)報道，綠原酸溶液在中性或堿性環(huán)境下含量明顯降低，而在酸性條件下含量變化不大，在pH 2～4較穩(wěn)定[12]；另外光線對綠原酸水溶液穩(wěn)定性的影響也較大，貯存和測定時應(yīng)注意避光[9]。

3.5 色譜峰的確認(rèn)

現(xiàn)有文獻(xiàn)中對照品替代法色譜峰的定位多采用相對保留時間法，但在實際操作中，使用不同品牌和規(guī)格色譜柱時，相對保留時間會有一定變化。根據(jù)本研究色譜峰的定性方法，需確認(rèn)樣品溶液色譜圖中在對照品替代法色譜峰的位置是否有其他物質(zhì)色譜峰干擾，應(yīng)采用色譜峰純度檢查進(jìn)行確認(rèn)。

4 小結(jié)

本研究采用對乙酰氨基酚對照品替代法法，用于石韋、金銀花、菊花、小兒咽扁顆粒中綠原酸含量的測定，確定了對乙酰氨基酚和綠原酸的相對校正因子，對其耐用性進(jìn)行考察，將測定結(jié)果與對照品外標(biāo)法進(jìn)行比對，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證。結(jié)果表明：不同儀器和不同色譜柱、不同流速、不同柱溫對相對校正因子f值無顯著影響。對照品外標(biāo)法和對照品替代法結(jié)果無顯著性差異。本研究認(rèn)為，對于石韋、金銀花、菊花、小兒咽扁顆粒中綠原酸含量的測定，已建立的對乙酰氨基酚與綠原酸之間的相對校正因子具有較高的可信度，可用對乙酰氨基酚替代價格貴、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的綠原酸。以對乙酰氨基酚代替綠原酸作為對照品，采用HPLC法測定綠原酸的含量進(jìn)行質(zhì)量控制，是經(jīng)濟(jì)、可行、實用的，可用于含綠原酸成分的中藥飲片及中成藥的含量測定。