基于近紅外光譜技術(shù)的當(dāng)歸養(yǎng)血丸多指標(biāo)成分快速分析與質(zhì)量評價(jià)

閆 研，謝耀軒，秦 斌，王鐵杰，殷 果

（深圳市藥品檢驗(yàn)研究院 深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518057）

當(dāng)歸養(yǎng)血丸由當(dāng)歸、白芍和地黃等十味藥材組成，收載于《中國藥典》2015年版（一部），具有益氣養(yǎng)血調(diào)經(jīng)功效，在臨床上多用于治療月經(jīng)不調(diào)、氣血兩虛等疾病[1]。在質(zhì)量控制方面，《中國藥典》2015年版只規(guī)定了當(dāng)歸、丹皮酚顯微鑒別項(xiàng)和薄層色譜（TLC）鑒別項(xiàng)，缺少含量測定項(xiàng)[1]；在含量測定方面，僅見相關(guān)文獻(xiàn)采用高效液相法分別測定阿魏酸、芍藥苷[2-7]。上述定性分析手段存在技術(shù)要求高、操作復(fù)雜、無法用于現(xiàn)場快速監(jiān)察等缺點(diǎn)。

近紅外光譜法（NIR），操作簡單，無需對樣品進(jìn)行前處理，無需消耗其他材料或試劑，是一種綠色環(huán)保的快速分析方法。近紅外光譜法以其快速、無損、綠色環(huán)保的特點(diǎn)廣泛應(yīng)用于藥品定性、定量分析中[8-9]，隨著技術(shù)發(fā)展成熟，逐漸應(yīng)用于中藥材、飲片的快速檢測，對于有效控制中藥質(zhì)量有重要應(yīng)用價(jià)值[10-16]。

本研究以2019年國家藥品評價(jià)性抽驗(yàn)為契機(jī)，采用NIR建立當(dāng)歸養(yǎng)血丸的一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ停鞍?、芍藥苷、丹皮酚在?nèi)的多指標(biāo)成分的定量分析模型，用于當(dāng)歸養(yǎng)血丸的快速定性鑒別和多成分定量分析與評價(jià)，以滿足當(dāng)歸養(yǎng)血丸藥品質(zhì)量控制的需要。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MATRIX-F型近紅外光譜儀，附有光纖探頭，InGaAs檢測器，OPUS5.0軟件。

1.2 試藥

本次國家評價(jià)性抽驗(yàn)的樣品共涉及3個生產(chǎn)廠家的11批次當(dāng)歸養(yǎng)血丸，經(jīng)深圳市藥品檢驗(yàn)研究院中藥檢驗(yàn)室符合性檢驗(yàn)，合格率為100 %，另收集了與其功能和成分相近的藥品4批，樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

按《中國藥典》2015年版通則0832水分測定法第四法操作[1]，測得當(dāng)歸養(yǎng)血丸水分的含量范圍為4.9 %～9.0 %；參考文獻(xiàn)方法[2]測得芍藥苷的含量范圍為1.30～2.37 mg/g ；參考文獻(xiàn)方法[6]測得丹皮酚的含量范圍為0.50～1.25 mg/g，各指標(biāo)成分測定值詳見表2。

2.2 光譜的采集

采用漫反射掃描法，通過光纖探頭采集樣品NIR圖譜。以儀器內(nèi)置背景為參比，波數(shù)范圍12 000～4000 cm-1，掃描累加次數(shù)32次，分辨率8 cm-1，每批次樣品重復(fù)測定6張光譜，作為原始光譜。1～15號樣品近紅外光譜疊加圖詳見圖1～2。

2.3 當(dāng)歸養(yǎng)血丸（A公司）一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>

近紅外一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪峭ㄟ^一致性指數(shù)（CI）值和CI限度比較法初篩樣品，方便快捷，準(zhǔn)確率高[8]。當(dāng)樣品量充足（≥3批次）時(shí)，可建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯λ幤返恼鎮(zhèn)芜M(jìn)行鑒別，亦可針對品牌產(chǎn)品建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?，用于對市場上該品牌藥進(jìn)行快速篩查。本研究對A公司和B公司兩家企業(yè)的當(dāng)歸養(yǎng)血丸分別建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以區(qū)分不同廠家的當(dāng)歸養(yǎng)血丸（品牌鑒別），或?qū)?dāng)歸養(yǎng)血丸和與其成分、功能相近的產(chǎn)品區(qū)分（真?zhèn)舞b別）。

表2 各指標(biāo)成分含量測定結(jié)果

圖1 樣品近紅外原始光譜疊加圖

圖2 近紅外二階導(dǎo)數(shù)加矢量歸一化處理光譜圖

2.3.1 模型的建立 調(diào)取編號1～7樣品的42張?jiān)脊庾V作為參考光譜，按照中國食品藥品檢定研究院發(fā)布的《近紅外光譜采集與建模技術(shù)規(guī)范》要求，采用二階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化法對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，平滑點(diǎn)數(shù)為13，選擇特征譜段在9000～7500 cm-1、6900～5600 cm-1和5000～4250 cm-1，CI限度為5，建立當(dāng)歸養(yǎng)血丸（A公司）一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?，詳見?和圖3。

表3 一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛥?shù)列表

2.3.2 模型的驗(yàn)證 調(diào)取編號10～15樣品各一張圖譜，共6張光譜作為檢驗(yàn)光譜，對當(dāng)歸養(yǎng)血丸（A公司）一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果見圖3，6批樣品的CI值均遠(yuǎn)大于規(guī)定的CI限度5，驗(yàn)證樣品與建模樣品差異顯著，說明該模型專屬性好，準(zhǔn)確性高，能有效區(qū)分當(dāng)歸養(yǎng)血丸（A公司）與不同生產(chǎn)廠家的同類產(chǎn)品及功能和成分相近的其他產(chǎn)品。

圖3 當(dāng)歸養(yǎng)血丸（A公司）一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證結(jié)果

2.4 當(dāng)歸養(yǎng)血丸（B公司）一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h3>

2.4.1 模型的建立 調(diào)取編號8～10樣品的原始光譜作為參考光譜，采用二階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化法對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理方法，平滑點(diǎn)數(shù)為13，選擇特征譜段在9000～7500 cm-1，6900～5600 cm-1和5000～4250 cm-1，CI限度為7，建立一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?，詳見?和圖4。

表4 一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛥?shù)列表

2.4.2 模型的驗(yàn)證 調(diào)取編號7，11～15樣品各一張圖譜，共6張光譜作為檢驗(yàn)光譜，對當(dāng)歸養(yǎng)血丸（B公司）一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果見圖4，6批樣品的CI值均遠(yuǎn)大于規(guī)定的CI限度7，驗(yàn)證樣品與建模樣品差異顯著，說明該模型專屬性好，準(zhǔn)確性高，能有效區(qū)當(dāng)歸養(yǎng)血丸（B公司）與不同生產(chǎn)廠家的同類產(chǎn)品、以及功能和成分相近的其他產(chǎn)品。

2.5 多指標(biāo)成分定量模型

采用偏最小二乘法（PLS）對當(dāng)歸養(yǎng)血丸中水分、芍藥苷、丹皮酚這3個關(guān)鍵指標(biāo)成分建立定量分析模型，用以預(yù)測未知樣品中各指標(biāo)成分的含量。

圖4 當(dāng)歸養(yǎng)血丸（B公司）一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證結(jié)果

2.5.1 模型的建立及優(yōu)化 運(yùn)用OPUS分析軟件，分別采用一階導(dǎo)數(shù)+多元散射校正（First Derivative+MSC）、一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化（First Derivative+Vector Normalization）、一階導(dǎo)數(shù)+直線差值（First Derivative+Straight Line Subtraction）等 11種光譜預(yù)處理方法在12 000～4000 cm-1范圍內(nèi)對光譜預(yù)處理方法和光譜范圍做系統(tǒng)的優(yōu)化，通過內(nèi)部交叉驗(yàn)證篩選較為優(yōu)化的模型參數(shù)，詳見表5。

表5 不同建模參數(shù)對各指標(biāo)定量模型的影響

以相關(guān)系數(shù)（R2）和交叉驗(yàn)證均方差（RMSECV）作為衡量指標(biāo)，R2越接近1，RMSECV值越小，模型的精確度越高，最終確定各指標(biāo)定量模型的建模參數(shù)，詳見表6。

2.5.2 模型的驗(yàn)證 運(yùn)用已建立的各指標(biāo)定量模型對各指標(biāo)含量進(jìn)行預(yù)測，并與實(shí)測值比較，結(jié)果見表7。預(yù)測值與實(shí)測值相關(guān)性見圖5，預(yù)測誤差分布見圖6。各指標(biāo)定量分析模型內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9492，0.9166，0.9260，交叉驗(yàn)證均方根偏差（RMSECV）分別為0.290 %，0.0833 mg/g，0.0726 mg/g，模型的預(yù)測能力良好。

3 討論

本研究因樣品數(shù)量有限，采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證的方法建模和驗(yàn)證，以保證模型的準(zhǔn)確性。交叉驗(yàn)證方法是：首選取出一個樣本，將剩余的樣本建立一個臨時(shí)模型，使用該模型來預(yù)測取出的這個樣本，如此重復(fù)、循環(huán)直至每個樣本均被檢驗(yàn)分析，特點(diǎn)是每個樣品均被用于建模和驗(yàn)證，適用于樣品數(shù)量有限（小于50個樣本）的系統(tǒng)建模，但運(yùn)算量較大。因此，在后續(xù)研究中應(yīng)收集更多、更具代表性的當(dāng)歸養(yǎng)血丸樣品，不斷擴(kuò)充到模型中，使模型更為穩(wěn)健、適用性更廣。

表6 各指標(biāo)定量模型的建模參數(shù)

表7 各指標(biāo)定量模型預(yù)測值與實(shí)測值比較

圖5 各指標(biāo)定量模型預(yù)測值與實(shí)測值相關(guān)圖

圖6 各指標(biāo)定量模型預(yù)測誤差分布圖

4 結(jié)論

本研究利用NIR分析技術(shù)，針對不同廠家的建立的一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢钥焖勹b別當(dāng)歸養(yǎng)血丸，所建模型專屬性好，準(zhǔn)確性高，可快速準(zhǔn)確鑒別出不同廠家的當(dāng)歸養(yǎng)血丸，可快速準(zhǔn)確地區(qū)分當(dāng)歸養(yǎng)血丸和與其功能、成分相近的同類產(chǎn)品。針對水分、芍藥苷和丹皮酚3個關(guān)鍵指標(biāo)成分建立的當(dāng)歸養(yǎng)血丸定量分析模型準(zhǔn)確性高，預(yù)測偏差在合理范圍內(nèi)，可用于未知樣品多指標(biāo)成分的含量預(yù)測。本研究建立的NIR快速分析方法操作簡單易掌握，樣品無需處理，為當(dāng)歸養(yǎng)血丸多指標(biāo)成分快速、無損檢測和質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持，具有廣闊的應(yīng)用前景。