生石花離體培養(yǎng)與快繁研究

邢一帆，陳 麗，張 杰，宋婷婷

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

生石花(Lithopskarasmontana)是番杏科生石花屬多年生的肉質(zhì)草本植物，體型小，像石頭半埋在地下，常見(jiàn)于巖床縫隙、石礫之中，盛夏至中秋開(kāi)花，又名石頭花[1]。生石花形如彩石，色彩豐富，株型小巧，一般盆栽于室內(nèi)觀賞，作為一種形狀多樣的盆栽植物廣受大眾的喜愛(ài)，其觀賞價(jià)值高，同時(shí)可以起到凈化空氣的作用，符合大眾對(duì)于花卉的消費(fèi)趨勢(shì)。生石花作為一種多肉植物，由于其獨(dú)有的特征，更是吸引越來(lái)越多人的喜愛(ài)，需求量逐漸上升導(dǎo)致其價(jià)格隨之上漲[1]。

生石花的繁殖靠種子或扦插[2]。由于扦插是由一個(gè)植株自然形成多個(gè)頭后，繁殖產(chǎn)生新植株，因此人們更側(cè)重于種子繁殖。一般采用室內(nèi)盆播，種子很容易發(fā)芽，但生石花的種子細(xì)小，從播種到成苗時(shí)間約2～3年，繁殖系數(shù)較低，難以滿足生產(chǎn)需要。為滿足市場(chǎng)的需求，快速大量繁殖生石花成為一個(gè)重要的問(wèn)題[2]。

近年來(lái)，植物組織培養(yǎng)作為快速繁殖的方法在不同植物中被廣泛應(yīng)用，其不但可以縮短植物的生長(zhǎng)周期，更為植物脫毒苗的培育提供可參考的方式。盡管部分多肉植物已經(jīng)能夠通過(guò)組織培養(yǎng)的方法快速繁殖，如白銀壽[3]、短葉巨象[4]、水晶掌[5]、白銀壽‘奇跡’[6]、玉露[7]，但有關(guān)生石花組織培養(yǎng)的報(bào)道還很少，只有種子的繁殖體系被建立，其葉肉組織培養(yǎng)體系尚未建立[8]。生石花與其他多肉植物的品種差異性較大，常規(guī)的培養(yǎng)基不能共用[3-7]。該研究以生石花的葉肉作為試驗(yàn)材料，利用組織培養(yǎng)的方法，篩選適宜生石花外植體離體培養(yǎng)的消毒時(shí)間、激素質(zhì)量濃度等條件，建立生石花快繁體系，旨在獲得品質(zhì)優(yōu)良、生長(zhǎng)快速的種苗，為后續(xù)生石花的品種培育和工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

生石花品種‘花紋玉’購(gòu)買(mǎi)于北京花鄉(xiāng)花卉市場(chǎng)，以生石花的葉肉作為材料。培養(yǎng)于北京農(nóng)學(xué)院科技綜合樓組培室，環(huán)境條件設(shè)置：光照強(qiáng)度2 000 lx，光照14 h/d，溫度(23±2) ℃，相對(duì)濕度55%[9]。

1.2 材料處理

外植體滅菌：選用大小相近的成熟生石花葉肉，清潔劑浸泡約15 min，自來(lái)水沖洗30 min備用。在超凈臺(tái)上用75%的乙醇沖洗，2%NaClO溶液浸泡，組合分別是5 s 75%的乙醇和8 min 2%NaClO溶液，5 s 75%的乙醇和12 min 2% NaClO溶液，30 s 75%的乙醇和8 min 2% NaClO溶液，30 s 75 %的乙醇和12 min 2% NaClO溶液；無(wú)菌水浸泡1～2 min，沖洗3～5遍。將消毒后的葉肉放置在無(wú)菌濾紙上，切成1～1.5 cm段作為外植體，接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 培養(yǎng)基種類和配方 啟動(dòng)培養(yǎng)基4種：培養(yǎng)基A1、培養(yǎng)基A2、培養(yǎng)基A3、對(duì)照培養(yǎng)基。培養(yǎng)基A1：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L；培養(yǎng)基A2：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L；培養(yǎng)基A3：MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.8 mg/L；對(duì)照培養(yǎng)基：MS(不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基3種：培養(yǎng)基B1、培養(yǎng)基B2、對(duì)照培養(yǎng)基。培養(yǎng)基B1：MS+NAA 0.4 mg/L+6-BA 2.0 mg/L；培養(yǎng)基B2：MS+NAA 0.8 mg/L+6-BA 4.0 mg/L；對(duì)照培養(yǎng)基：MS(不添加任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)。

生根培養(yǎng)基4種：培養(yǎng)基C1、培養(yǎng)基C2、培養(yǎng)基C3、培養(yǎng)基C4。生根培養(yǎng)基配方為1/2MS基本培養(yǎng)基，瓊脂粉7 g/L，蔗糖20 g/L，pH調(diào)至6.0。培養(yǎng)基C1：1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.00 mg/L；培養(yǎng)基C2：1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.10 mg/L；培養(yǎng)基C3：1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L；培養(yǎng)基C4：1/2MS+6-BA 0 mg/L+NAA 0.10 mg/L。

1.3.2 啟動(dòng)培養(yǎng) 將試驗(yàn)材料放置于啟動(dòng)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基pH調(diào)至6.0，蔗糖30.0 g/L，瓊脂7.0 g/L。每瓶培養(yǎng)基接種4個(gè)外植體，共計(jì)4個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。接種30 d后觀察組培瓶?jī)?nèi)外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)，待其生長(zhǎng)成熟后備用。

1.3.3 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 將膨大的外植體切割為長(zhǎng)約1.0 cm的段，隨后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每瓶培養(yǎng)基接種4個(gè)外植體，共計(jì)3個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。接種30 d后觀察組培瓶?jī)?nèi)外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)及愈傷組織的生長(zhǎng)情況，篩選出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

為檢測(cè)生石花芽的分化率，將生長(zhǎng)狀態(tài)較好的愈傷組織分別接種在適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種5塊愈傷組織，設(shè)置5個(gè)重復(fù)，30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3.4 生根培養(yǎng) 待植株長(zhǎng)至2 cm以上時(shí)，通過(guò)無(wú)菌操作將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中。每瓶接種叢生芽3個(gè)，每處理5個(gè)重復(fù)，光照時(shí)間延長(zhǎng)為16 h/d，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率及生根條數(shù)，選擇最適的生根培養(yǎng)基。

1.3.5 煉苗與移栽 待植物組織的根系健壯，能夠達(dá)到移栽的狀態(tài)后進(jìn)行煉苗處理。煉苗的具體步驟：在無(wú)菌室內(nèi)先松蓋1～2 d讓其適應(yīng)外界環(huán)境，部分開(kāi)蓋，直至完全揭蓋；然后移到室外進(jìn)行自然光照7～10 d，遮陰約為60%，煉苗完成后將組培苗進(jìn)行移栽。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)菌率及成活率

生石花外植體進(jìn)行消毒處理試驗(yàn)，設(shè)置75%的乙醇和2%的NaClO溶液的4種不同時(shí)間梯度，經(jīng)過(guò)30 d培養(yǎng)，5 s 75%酒精和8 min 2% NaClO溶液的處理最合適，外植體愈傷組織膨大，有分化趨勢(shì)，并且無(wú)菌率高達(dá)41.2%，成活率高達(dá)45.6%(表1)。雖然將2%的NaClO溶液的消毒時(shí)間延長(zhǎng)至12 min后，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，卻產(chǎn)生乳白色污染(圖1)。另外，盡管30 s 75%的乙醇和8 min NaClO溶液的處理無(wú)菌率和成活率較高，但是愈傷組織小、緊皺，沒(méi)有分化趨勢(shì)，不適合后期的植株生長(zhǎng)。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)生石花愈傷組織的影響Tab.1 Effects of different disinfection methods on Lithops karasmontana callus

注：小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

2.2 啟動(dòng)培養(yǎng)

將外植體接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上，其中培養(yǎng)基A1為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，愈傷組織狀態(tài)較好，生芽率高，分化效果良好；出芽率高達(dá)65.2%。培養(yǎng)基A3的出芽率31.4%，但是愈傷組織狀態(tài)不好，呈現(xiàn)出黃綠色，僅有少量芽點(diǎn)出現(xiàn)，分化一般；培養(yǎng)基A2和對(duì)照培養(yǎng)基的出芽率不足10%。培養(yǎng)基A1確定為最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基，見(jiàn)表2。

表2 不同激素組合對(duì)生石花愈傷誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different combinations of hormones on callus induction of Lithops karasmontana

注：小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)

外植體由于經(jīng)過(guò)啟動(dòng)培養(yǎng)后膨大，需將其切割成1.0 cm左右，再接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行篩選。其中培養(yǎng)基B1：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)65.7%，叢芽分化率高達(dá)75.2%，培養(yǎng)基B1確定為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，見(jiàn)表3。培養(yǎng)基B2愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)53.5%，叢芽分化率高達(dá)58.4%，僅次于培養(yǎng)基B1對(duì)外植體的影響，同時(shí)說(shuō)明激素質(zhì)量濃度越高，對(duì)植物的生長(zhǎng)不是越好[5,10]；由于培養(yǎng)基B3沒(méi)有加入激素，愈傷誘導(dǎo)率和分化率均為0，不具有影響能力，結(jié)果如圖1所示。

2.4 生根培養(yǎng)

為了確定生石花的最適光照時(shí)間，將即將生根的植株放置于8 h和16 h的光照條件下，30 d后，植株在16 h的時(shí)間范圍中，無(wú)論植株形態(tài)或根生長(zhǎng)情況都符合正常觀賞要求，且顏色美艷(圖2)。而8 h光照條件下的植株由于光照不夠，長(zhǎng)勢(shì)奇怪，不符

表3 不同激素質(zhì)量濃度對(duì)生石花愈傷增殖和分化的影響Tab.3 Effects of different hormone concentrations on callus proliferation and differentiation of Lithops karasmontana

注：小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

培養(yǎng)基6-BA/(mg/L )NAA/(mg/L)平均根數(shù)生根率/%C11.01.000.00.0C20.50.109.951.4 aC30.10.016.318.5bC40.00.105.68.3 c

注：小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different letters indicate that there is significant difference (P<0.05).

合生石花的觀賞特征，所以，試驗(yàn)最終將最佳光照時(shí)間設(shè)定為16 h(圖3)。

待生石花植株長(zhǎng)至2 cm以上時(shí)，在無(wú)菌條件下取出健壯植株，接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。其中培養(yǎng)基C2：1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，平均根數(shù)最多為9.9，生根率最高，達(dá)到了51.4%，培養(yǎng)基C2確定為最佳生根培養(yǎng)基，見(jiàn)表4。

3 討 論

該試驗(yàn)以生石花葉肉作為外植體，通過(guò)設(shè)置不同消毒時(shí)間處理，篩選出5 s 75%乙醇和8 min 2% NaClO溶液為最適消毒方式，但是為了進(jìn)一步提高外植體的無(wú)菌率和成活率，消毒時(shí)間仍需要繼續(xù)優(yōu)化改良。30 s 75%的乙醇和8 min 2%的NaClO溶液的消毒時(shí)間使得材料愈傷組織小，愈傷組織上多白色透明細(xì)小珠點(diǎn)，材料的愈傷組織明顯減少，并且緊實(shí)。當(dāng)外植體接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)30 d培養(yǎng)后，觀察外植體變化情況。培養(yǎng)基A1、培養(yǎng)基A2、培養(yǎng)基A3的外植體呈現(xiàn)膨大和愈傷化現(xiàn)象，對(duì)照培養(yǎng)基外植體萎縮，無(wú)分化。對(duì)4種試驗(yàn)處理后的外植體狀態(tài)進(jìn)行比較，只有當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA 2.0 mg/L時(shí)，生石花葉肉切面分化出具有增殖能力的黃綠色愈傷組織，能夠在后續(xù)過(guò)程中繼續(xù)誘導(dǎo)和分化[11-12]。培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L時(shí)，出芽率高達(dá)65.2%。激素對(duì)植物組織分化的形成具有重要作用，選擇合適的激素質(zhì)量濃度對(duì)植物組織培養(yǎng)十分重要[13]。由于多肉植物的快繁體系多以1/2MS作為基本培養(yǎng)基[14]，該試驗(yàn)采取相同的方法，培養(yǎng)效果良好。與此同時(shí)，在1/2MS培養(yǎng)基中加入適量NAA能夠有效誘導(dǎo)植物生根[4,8,15]，生根率可達(dá)51.4%。根系質(zhì)量良好，明顯高于未添加NAA的對(duì)照培養(yǎng)基。生根后的植物材料移栽成功率高達(dá)90%，生長(zhǎng)良好。

由于生石花原產(chǎn)于熱帶地區(qū)，其在引種之前接受的光照時(shí)間和光照強(qiáng)度顯著高于培養(yǎng)條件。高強(qiáng)度的光照使其具有顏色鮮艷，莖部粗壯等特點(diǎn)，而缺乏光照會(huì)對(duì)其生理狀態(tài)造成至關(guān)重要的影響[1,16]。8 h條件下，植株出現(xiàn)畸形等癥狀，不適合觀賞；而16 h的光照條件下，植株形態(tài)優(yōu)美，且顏色美艷。該試驗(yàn)最終將最佳光照時(shí)間設(shè)定為16 h，與前人的研究結(jié)果一致[1,17]。

該試驗(yàn)以生石花的葉肉為試驗(yàn)材料，對(duì)消毒時(shí)間和質(zhì)量濃度進(jìn)行篩選，確定最適宜的培養(yǎng)基條件，建立組培快繁體系。該體系能夠快速、高效繁殖生石花組培苗植株，縮短育種周期，提高外植體的生根率。提高生石花生長(zhǎng)速度，彌補(bǔ)了繁殖效率低等缺陷，獲得完整的生石花組織快繁體系，提高種苗質(zhì)量，可用于生石花的大量生產(chǎn)繁殖，是一種通用性強(qiáng)，建立繁殖速度快的生石花組織培養(yǎng)體系，為今后生石花組培苗生產(chǎn)提供參考。