基于MIRA技術(shù)的霍亂弧菌膠體金試紙條快速檢測(cè)方法的建立

李盛杰 江海濤 吳雨龍

摘要：為了建立一種快速、靈敏、便捷的針對(duì)霍亂弧菌的檢測(cè)方法，利用多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)不同引物組在膠體金試紙條檢測(cè)中的特異性和靈敏度進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，在以質(zhì)粒為模板的特異性試驗(yàn)中，Probe1+引物對(duì)2、Probe1+引物對(duì)3、Probe2+引物對(duì)5這3組引物組均顯示出較高的特異性。但在靈敏度試驗(yàn)中，僅有Probe2+引物對(duì)5能夠檢出濃度為0.1 fg/μL的質(zhì)粒模板。在后續(xù)以核酸為模板的特異性和靈敏度試驗(yàn)中，Probe2+引物對(duì)5的引物組合同樣顯示出較強(qiáng)的特異性，并對(duì)核酸模板的檢出限可達(dá)到10 fg/μL，均顯示出優(yōu)于另外2種組合的特異性和靈敏度。本研究所建立的基于MIRA技術(shù)的霍亂弧菌檢測(cè)方法具有較高的特異性和靈敏度，對(duì)于推進(jìn)霍亂弧菌及其他致病菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)具有重要意義。

關(guān)鍵詞：霍亂弧菌;多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù);膠體金試紙

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）24-0167-05

收稿日期：2021-09-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2019YFC1605800）;江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（編號(hào)：20KJA416003）;江蘇省高校重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號(hào)：蘇教科[2016]8）。

作者簡(jiǎn)介：李盛杰（1988—），男，江蘇徐州人，博士，講師，從事特殊生物質(zhì)資源利用研究。E-mail：lishengjie@njxzc.edu.cn。

通信作者：吳雨龍，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事動(dòng)物生理生化相關(guān)研究。E-mail：wuyl_8080@163.com。

霍亂弧菌（Vibrio cholera）是一種革蘭氏陰性菌，是霍亂的病原體?；魜y可作為散發(fā)性、流行性或地方病發(fā)生，以引起嚴(yán)重腹瀉和脫水而聞名，如果不及時(shí)治療，可在48 h內(nèi)導(dǎo)致死亡[1]。研究表明，霍亂弧菌可以通過(guò)人類宿主形成高度傳染性狀態(tài)，經(jīng)排泄到自然環(huán)境中，引發(fā)霍亂的流行[2]。霍亂弧菌廣泛存在水生動(dòng)物中或受污染的食物中，特別是貝類和甲殼類動(dòng)物[3]。因此，建立霍亂弧菌快速、高效的檢測(cè)手段，對(duì)于保障食品質(zhì)量安全，維護(hù)人民生命健康，加強(qiáng)公共衛(wèi)生防疫方面具有極其重要的意義。由于霍亂弧菌可以以2種形式存在：活的可培養(yǎng)的和活的但不可培養(yǎng)的（VBNC），使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)具有一定的局限性[4]。目前，針對(duì)霍亂弧菌檢測(cè)的方法雖然很多，包括免疫檢測(cè)法、生化鑒定法、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等方法，但這些方法均無(wú)法同時(shí)解決操作煩瑣耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)效率與檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)目標(biāo)單一、快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問(wèn)題[5-10]。

MIRA（Multi-enzyme Isothermal Rapid Amplification，簡(jiǎn)稱MIRA）是一種近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。作為一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，MIRA不需要復(fù)雜的熱循環(huán)儀，而是通過(guò)簡(jiǎn)單的水浴或加熱工具即可在37～42 ℃的恒定溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程主要依賴于3種必需的酶：重組酶，促進(jìn)特異性引物與模板DNA 配對(duì);單鏈 DNA 結(jié)合蛋白，無(wú)需加熱即可形成單鏈DNA;DNA 聚合酶，負(fù)責(zé)擴(kuò)增和延伸[11]。一旦反應(yīng)開(kāi)始，模板DNA的擴(kuò)增就會(huì)迅速進(jìn)行，并且在不到 20 min的時(shí)間內(nèi)達(dá)到可檢測(cè)的水平。通過(guò)設(shè)計(jì)帶有修飾基團(tuán)的引物與探針，配合膠體金試紙條，可以極大地實(shí)現(xiàn)便攜式的現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè)技術(shù)。

霍亂毒素（CT）、毒素共調(diào)節(jié)菌毛（TCP）和外膜蛋白W（OmpW）是霍亂弧菌的3個(gè)主要毒力因子[12]。外膜蛋白W的ompW基因也是霍亂弧菌菌株鑒定中常用的特異性檢測(cè)基因。本研究主要針對(duì)該基因設(shè)計(jì)多個(gè)引物和探針組，并在多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增體系中通過(guò)膠體金試紙條對(duì)霍亂弧菌的特異性和靈敏度檢測(cè)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍亂弧菌ompW基因質(zhì)粒（參考GenBank：MF100045.1序列信息構(gòu)建）;Tiosbio超快速核酸釋放劑、DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒、HybriDetect試紙條均購(gòu)自濰坊安普未來(lái)生物科技有限公司;霍亂弧菌、小腸耶爾森氏菌的核酸提取物購(gòu)自濰坊安普未來(lái)生物科技有限公司;副溶血性弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌分離株、創(chuàng)傷弧菌、鮑氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、坂崎克羅諾菌均來(lái)自筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 儀器

PCR擴(kuò)增儀，T100TM，Bio-rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2021年3—6月在南京曉莊學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)MIRA技術(shù)引物設(shè)計(jì)原則，建議擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在150～500 bp之間，下游引物的5′端需要標(biāo)記1個(gè)修飾基團(tuán)（如生物素，biotin）。結(jié)合霍亂弧菌ompW基因（GenBank：MF100045.1）序列信息，采用PrimerPremier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，委托廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成，具體序列見(jiàn)表1。

1.3.2 探針設(shè)計(jì) 根據(jù)MIRA技術(shù)探針設(shè)計(jì)原則（圖1），探針為位于上下游引物中間，長(zhǎng)度在46～52 nt之間，并與目的片段互補(bǔ)的序列;同時(shí)在5′端修飾1個(gè)抗原標(biāo)記（如羥基熒光素，F(xiàn)AM）;在距5′端約30 nt序列位置上標(biāo)記1個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為大腸桿菌核酸外切酶（NFO）的識(shí)別位點(diǎn);THF距離3′末端約15 nt，并且在3′末端標(biāo)記1個(gè)修飾基團(tuán)（如胺基、磷酸基團(tuán)、C3-spacer）。結(jié)合7對(duì)引物信息，設(shè)計(jì)得到符合引物對(duì)1、2、3、4的探針Probe1（[6FAM]AACATTTGCCACCTACCTTTATGGTCCAAT[THF]CTACTTTGGTGAAGC[C3spacer]）和符合引物對(duì)4、5、6的探針Probe2（[6FAM]AGTAGCGATAAAGTGTTAAACACTCAAAGT[THF]AGTTGGCAGTTAATA[C3spacer]）。

1.3.3 膠體金試紙條試驗(yàn)反應(yīng)體系 膠體金試紙條試驗(yàn)反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

1.3.4 膠體金試紙條試驗(yàn)操作步驟 在每個(gè)反應(yīng)管中加入適量的Buffer A、上下游引物、探針（探針引物濃度均為10 μmol/L）、ddH2O、核酸模板、BufferB，并充分混合，短暫離心后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中37 ℃孵育8～12 min;反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL反應(yīng)液加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中3～5 min，觀察質(zhì)控線與檢測(cè)線判讀結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒模板試紙條特異性

選擇7組引物和對(duì)應(yīng)的探針，將霍亂弧菌ompW基因質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行膠體金試紙條特異性反應(yīng)的初篩。膠體金試紙條初篩結(jié)果顯示，每組檢測(cè)線均出現(xiàn)了條帶，說(shuō)明不同的引物探針組均能檢出質(zhì)粒濃度10 fg/μL以上的目標(biāo)分子，其中2、3、5組條帶最為明顯（圖2）。因此，選擇這3對(duì)引物及對(duì)應(yīng)探針進(jìn)行后續(xù)膠體金試紙條的靈敏度試驗(yàn)。

2.2 質(zhì)粒模板試紙條靈敏度

選擇引物對(duì)2和探針Probe1的組合，將質(zhì)粒模板稀釋為10.00、1.00、0.10、0.01 fg/μL 4個(gè)梯度濃度進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，第2組檢測(cè)線有微弱條帶出現(xiàn)，表明該探針引物組合可以檢出濃度為1 fg/μL的質(zhì)粒模板（圖3）。

選擇引物對(duì)3和探針Probe1的組合，將質(zhì)粒模板稀釋為相同的4個(gè)梯度濃度進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該探針引物組合在第2組檢測(cè)線同樣可以看到微弱條帶，也可檢出濃度為1 fg/μL的質(zhì)粒模板（圖4）。

選擇引物對(duì)5和探針Probe2的組合，利用同樣稀釋后的質(zhì)粒模板進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該探針引物組合在第3組檢測(cè)線可以看到微弱條帶，表明其可以檢出濃度為 0.1 fg/μL 的質(zhì)粒模板（圖5）。

2.3 核酸模板試紙條靈敏度

為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法在真實(shí)檢測(cè)環(huán)境中的效率，選擇從霍亂弧菌中提取的核酸作為模板進(jìn)行靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)。選擇引物對(duì)2和探針Probe1的組合，設(shè)置1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL 3個(gè)梯度核酸模板濃度進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，第1、2組檢測(cè)線有明顯條帶出現(xiàn)，表明該探針引物組合可以檢出濃度為100 fg/μL的核酸模板（圖6）。

選擇引物對(duì)3和探針Probe1的組合，將核酸模板稀釋為相同的3個(gè)梯度濃度進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該探針引物組合在第1組、第2組檢測(cè)線有明顯條帶出現(xiàn)，在第3組檢測(cè)線可以看到微弱條帶，表明可以檢出濃度為 10 fg/μL 的核酸模板（圖7）。

選擇引物對(duì)5和探針Probe2的組合，利用同樣稀釋后的核酸模板進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該探針引物組合在第1組、第2組、第3組檢測(cè)線均可以看到明顯條帶，表明其可以檢出濃度為10 fg/μL的核酸模板（圖8）。

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，無(wú)論是在ompW基因質(zhì)粒模板的靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)中還是在霍亂弧菌核酸模板的靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)中，引物對(duì)5+Probe2的組合均表現(xiàn)出最優(yōu)的靈敏度檢測(cè)結(jié)果。因此，選擇該探針引物組合進(jìn)行不同物種間的特異性檢測(cè)試驗(yàn)。

2.4 不同致病菌核酸模板試紙條特異性試驗(yàn)結(jié)果

在不同致病菌核酸模板的特異性檢測(cè)試驗(yàn)中，本研究選擇了4種其他弧菌（副溶血性弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌、創(chuàng)傷弧菌）和6種可致消化系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)細(xì)菌（鮑氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌、小腸耶爾森氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、坂崎克羅諾菌）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，引物對(duì)5+Probe2的組合對(duì)于其他致病菌核酸模板的檢出結(jié)果均為陰性，只有對(duì)霍亂弧菌核酸的檢出結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明該探針引物組合可以特異性地檢出霍亂弧菌而不檢出其他微生物（圖9）。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)對(duì)全部7對(duì)引物探針組進(jìn)行初篩，顯示引物對(duì)2+Probe1、引物對(duì)3+Probe1和引物對(duì)5+Probe2的組合在試紙條檢測(cè)線均出現(xiàn)顯著明亮的條帶。在后續(xù)通過(guò)質(zhì)粒模板和核酸模板進(jìn)行靈敏度檢測(cè)的過(guò)程中，引物對(duì)5+Probe2的組合均表現(xiàn)出最優(yōu)的靈敏度，檢出限分別可達(dá)到0.1 fg/μL和 10 fg/μL。在不同致病菌核酸模板的特異性檢測(cè)試驗(yàn)中，引物對(duì)5+Probe2的組合同樣表現(xiàn)出良好的特異性，在所有11種檢測(cè)對(duì)象中，僅能檢測(cè)出霍亂弧菌而不檢出其他微生物。綜上判斷，我們認(rèn)為引物對(duì)5+Probe2的探針引物組通過(guò)膠體金試紙條在多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增條件下，能夠特異性好和靈敏度高地完成霍亂弧菌的快速檢測(cè)。本試驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法，無(wú)需依賴細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)分群等周期長(zhǎng)、操作繁瑣的手段，比常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)有更短的反應(yīng)時(shí)間，比環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法具有更低的反應(yīng)溫度，適用于食品安全檢測(cè)、病原體臨床診斷等領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣闊，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

本研究建立了一種基于MIRA技術(shù)的霍亂弧菌膠體金試紙條快速檢測(cè)方法，試驗(yàn)結(jié)果表明，引物對(duì)5+Probe2的探針引物組具備準(zhǔn)確可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。該探針引物組可以通過(guò)后期開(kāi)發(fā)成便攜且操作簡(jiǎn)單便利的一體化檢測(cè)試劑盒，用于實(shí)際生產(chǎn)和監(jiān)測(cè)環(huán)節(jié)中對(duì)霍亂弧菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

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