• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹耐寒性生理生化的影響

    2021-01-07 07:32:58張續(xù)周李金秋陳雪津王雯李芳馬媛春房婉萍朱旭君
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年24期
    關(guān)鍵詞:耐寒性低溫脅迫茶樹

    張續(xù)周 李金秋 陳雪津 王雯 李芳 馬媛春 房婉萍 朱旭君

    摘要:綠葉揮發(fā)物(GLVs)作為植物揮發(fā)物中的一類化合物,由C18和C16不飽和脂肪酸經(jīng)酶催化分解形成的C6和C9醛、醇及其相應(yīng)酯類組成。其中,乙酸葉醇酯是一種主要的GLVs,以Z-3-己烯醛和Z-3-己烯醇經(jīng)酶作用合成。為了解乙酸葉醇酯在茶樹耐寒性狀中的作用,以一年生茶樹品種中茶108為材料,使用乙酸葉醇酯后短時低溫(4 ℃,1.5 h)和低溫過夜(4 ℃,16 h)處理茶苗,測定茶樹冷誘導(dǎo)基因表達和茶樹生理生化特性指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),乙酸葉醇酯在短時低溫處理時可以提高冷誘導(dǎo)基因CsICE1、CsICE2、CsCBF1-CsCBF5的表達;在過夜低溫處理時提高冷誘導(dǎo)基因CsRD1、CsRD2的表達;短時低溫和過夜低溫處理均能分別顯著提高茶樹過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的酶活性,從而緩解低溫脅迫對茶樹的傷害。此外,乙酸葉醇酯還誘導(dǎo)自身合成途徑關(guān)鍵酶基因CsADH1、CsADH3和CsLOX3的表達,進一步增強茶樹耐寒能力。

    關(guān)鍵詞:茶樹;綠葉揮發(fā)物;乙酸葉醇酯;低溫脅迫;耐寒性

    中圖分類號:S571.101 文獻標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2021)24-0127-06

    收稿日期:2021-08-23

    基金項目:國家自然科學(xué)基金(編號:31800588);青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動基金(編號:1118025);山東省良種工程子課題(編號:2321401);青島職業(yè)技術(shù)學(xué)院重點研發(fā)專項(編號:2020ZDYF09);北茶技藝技能傳承創(chuàng)新平臺資助。

    作者簡介:張續(xù)周(1972—),男,山東菏澤人,碩士,副教授,主要從事茶樹育種與生物技術(shù)研究。E-mail:jiaonancha@126.com。

    通信作者:朱旭君,博士,副教授,研究方向為茶樹育種與栽培。E-mail:zhuxujun@njau.edu.cn。

    低溫是茶樹生長發(fā)育中遭受的主要非生物脅迫之一,限制了茶樹的生長發(fā)育[1]。低溫會影響細胞膜流動性,破壞細胞骨架,影響自由基產(chǎn)生和清除系統(tǒng)的平衡以及引起酶活性的改變等[2-4]。此外,低溫還會引起茶樹中兒茶素、維生素和氨基酸等品質(zhì)成分的變化[5]。茶樹受到低溫脅迫時,會發(fā)生一系列反應(yīng)以提高自身對低溫的抵抗能力,這種現(xiàn)象稱為冷馴化[5]。冷馴化過程涉及大量的生理生化變化,其中包括冷誘導(dǎo)基因的表達,調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)的生成和抗氧化酶系統(tǒng)的作用等途徑。

    某些冷誘導(dǎo)基因在低溫脅迫中的作用已經(jīng)明確[6-8],如ICE(inducer of CBF expression)在收到冷脅迫信號后,與CBF(C-repeat binding factor)啟動子結(jié)合誘導(dǎo)CBF基因表達[9],CBF識別CRT/DRE順式作用元件調(diào)控下游COR(cold regulate)基因的轉(zhuǎn)錄,編碼親水性多肽增強細胞脂膜穩(wěn)定性從而提高植物抗寒性[10]。其中,COR基因是一類在低溫下可以快速表達的植物抗寒基因,也可以稱為LTI(low temperature induced)、KIN(cold induced)、RD(response to dehydration)、ERD(early dehydration induced)基因[11]。

    綠葉揮發(fā)物(green leaf volatiles,簡稱GLVs)是植物揮發(fā)物中的一類化合物,包括C16和C18不飽和酶和異構(gòu)酶等作用下生成相應(yīng)的醇和酯類[12-13]。脂氧合酶(lipoxygenase,簡稱LOX)和氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide yase,簡稱HPL)作為脂氫過氧化物裂解酶催化形成C6和C9醛,進一步通過脂質(zhì)代謝途徑合成GLVs[12-15]。同時,GLVs含量也對合成酶具有反饋調(diào)節(jié)作用,如外源施用順-3-己烯醇能在24 h內(nèi)顯著誘導(dǎo)茶樹LOX和ADH基因的表達[16]。GLVs在植物遭受機械損傷,草食性昆蟲蟲害,病原菌感染[15]時發(fā)揮防御作用;干旱、高溫、低溫[13]、強光和重金屬等非生物脅迫[17-19]也會促進GLVs的釋放。此外,外源施用生長素和赤霉素也會誘導(dǎo)甜瓜CmLOX09基因的表達[20]。外源Z-3-己烯醇可以通過反向調(diào)節(jié)自身合成關(guān)鍵酶基因LOXs、ADHs的表達,誘導(dǎo)DREB-2A和RDs基因表達并通過提高抗氧化酶活性等途徑提高茶樹對干旱脅迫的抗性[18]。乙酸葉醇酯是一種主要的綠葉揮發(fā)物,Z-3-己烯醛和Z-3-己烯醇(Z-3-HAC)經(jīng)乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,簡稱ADH)和?;D(zhuǎn)移酶(acyltransferase,AAT)作用最終生成乙酸葉醇酯,乙酸葉醇酯在茶樹中的作用研究還未曾見。

    本研究通過外源使用乙酸葉醇酯,測定低溫處理后茶苗相關(guān)的生理特性指標(biāo)和冷誘導(dǎo)基因表達情況,初步明確了乙酸葉醇酯在茶樹抗寒性中的作用,為進一步深入研究乙酸葉醇酯在茶樹低溫脅迫中的作用機制提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    供試材料茶樹品種中茶108為一年生扦插茶苗,購于南京雅潤茶業(yè)有限公司。于2019年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)實驗室進行試驗處理。茶苗處理前在人工氣候箱中培養(yǎng)2個星期,培養(yǎng)條件為光照 16 h(25 ℃)/黑暗8 h(20 ℃),光照度3 600 lx,相對濕度60%~70%。

    1.2 試驗方法

    T1(短時低溫處理):乙酸葉醇酯(溶劑為二氯甲烷)處理1.5 h,4 ℃低溫處理1.5 h;CK1(短時低溫對照):二氯甲烷處理1.5 h,室溫放置3 h,4 ℃低溫處理1.5 h。T2(低溫過夜處理):乙酸葉醇酯(溶劑為二氯甲烷)處理1.5 h,室溫放置0.5 h,4 ℃低溫處理16 h;CK2(低溫過夜對照):二氯甲烷處理1.5 h,室溫放置0.5 h,4 ℃低溫處理16 h。取第1、2葉放入液氮速凍,-80 ℃保存。

    1.3 測定指標(biāo)及方法

    參照酸性茚三酮顯色法測定游離脯氨酸含量;采用超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過氧化物酶(POD)試劑盒和過氧化氫酶(CAT)試劑盒測定相應(yīng)酶活性,試劑盒均購于南京建成生物工程研究所有限公司;高效液相色譜法GB/T 8313—2008測定茶葉中兒茶素各組分含量。

    葉片總RNA使用艾德萊 RN5301 EASYspin Plus 多糖多酚/復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒提取。RNA 反轉(zhuǎn)錄使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser(日本 TaKaRa 生物公司)試劑盒進行。利用qRT-PCR反應(yīng)測定茶樹GLVs合成相關(guān)基因CsADH和CsLOX,以及抗寒相關(guān)基因CsICE、CsCBF和CsRD的相對表達量?;诓铇浠蚪M數(shù)據(jù)庫(http://tpia.teaplant.org/index.html)獲得茶樹相關(guān)基因序列,利用Primer5設(shè)計特異性引物(表1)。qRT-PCR反應(yīng)試驗使用SYBR Green PCR master mix試劑盒(日本TaKaRa生物公司),儀器使用Bio-Rad IQ5實時熒光定量儀(Bio-Rad,USA),內(nèi)參基因為β-actin。定量反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)[21]。每個處理試驗重復(fù)3次,基因相對表達量分析采用2ΔΔCT法計算。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2010和SPSS Statistic 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析,方差分析多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法,P<0.05表示差異顯著。采用Graphpad Prism 5作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹GLVs合成相關(guān)基因表達的影響

    茶樹中GLVs主要來源于亞麻酸降解途徑,該途徑中的關(guān)鍵酶為LOX、HPL和ADH。外源Z-3-己烯醇能在24 h內(nèi)顯著誘導(dǎo)茶樹LOXs、ADHs部分基因積累,對HPL無明顯效果[18]。為了解低溫環(huán)境下外源施用乙酸葉醇酯對GLVs合成途徑關(guān)鍵酶基因的影響,測定CsADH1、CsADH2、CsADH3和CsLOX1、CsLOX2、CsLOX3的表達情況,結(jié)果(圖1)表明,短時低溫(4 ℃,1.5 h)下外源乙酸葉醇酯顯著提高了CsLOX3積累量(P<0.05),顯著抑制了CsADH1、CsADH2、CsADH3的表達。 低溫過夜處理(4 ℃,16 h)中外源乙酸葉醇酯處理使CsADH1、CsADH3和CsLOX3表達量顯著增加,CsADH2和CsLOX1表達量顯著降低。

    2.2 低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹耐寒相關(guān)基因表達的影響

    茶樹在低溫脅迫下,一些冷誘導(dǎo)基因表達會上調(diào),CsICE和CsCBF是低溫信號傳遞中的重要元件,能夠感受上游信號并將低溫信號向下游傳遞[22-24]。為明確外源施用乙酸葉醇酯對低溫脅迫下冷誘導(dǎo)基因表達的影響,測定了CsICEs、CsCBFs和CsRDs部分基因的表達情況(圖2)。短時低溫處理(4 ℃,1.5 h)中外源乙酸葉醇酯顯著提高了CsICE1、CsICE2和CsCBF1~CsCBF5的表達量;CsRD1-CsRD3表達降低。 低溫過夜處理(4 ℃,16 h)中, 外源乙酸葉醇酯處理使CsICE1、CsRD1 和CsRD2積累增加,顯著降低了CsCBF1~CsCBF5和 CsRD2的表達量,對CsICE2無顯著影響。

    2.3 低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹生理指標(biāo)的影響

    2.3.1 茶樹保護酶活性 茶樹在受到低溫脅迫時

    產(chǎn)生大量活性氧會使膜脂發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),為保護細胞免受傷害,抗氧化酶系統(tǒng)被激活。通過測定茶樹抗氧化酶系統(tǒng)中重要的氧化酶SOD、POD和CAT活性,發(fā)現(xiàn)外源乙酸葉醇酯使POD活性在短時低溫(T1)和低溫過夜處理(T2)時均增加;SOD和CAT活性在施用乙酸葉醇酯后低溫過夜處理時表達量增加,但在未施用乙酸葉醇酯的短時低溫處理中表達量更高(圖3)。

    2.3.2 茶樹游離脯氨酸含量 脯氨酸是植物細胞抗寒的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一,在低溫脅迫下,游離脯氨酸含量會增加,以增加細胞液濃度,增強細胞保水能力,從而增強細胞耐寒性[2]。外源乙酸葉醇酯使短時低溫(T1)和過夜低溫處理(T2)中茶樹葉片游離脯氨酸含量均降低,分別降低了16.76%和69.68%(圖4)。

    2.3.3 茶樹葉片中兒茶素和咖啡堿含量 低溫脅迫會影響茶樹葉片中理化成分的合成,進而影響茶葉的品質(zhì),本試驗測定了茶葉中主要兒茶素單體成分和咖啡堿含量(圖5),施用外源乙酸葉醇酯,茶樹葉片中GC的含量在低溫過夜處理(T2)相對更高,茶樹葉片中ECG和CG在短時低溫處理時(T1)含量均增加。外源乙酸葉醇酯處理在茶樹短時和過夜低溫處理時,咖啡堿含量均明顯減少。

    3 討論與結(jié)論

    植物正常生長情況下體內(nèi)只存在極少量的綠葉揮發(fā)物,在受到機械損傷、低溫、干旱和蟲害等外界脅迫時,能迅速釋放大量綠葉揮發(fā)物來抵抗外界脅迫[25]。本試驗在低溫脅迫前使用乙酸葉醇酯進行處理,通過研究短時低溫處理和過夜低溫處理中茶樹葉片LOXs、ADHs部分基因和冷脅迫誘導(dǎo)基因ICEs、CBFs和CORs家族部分成員的表達情況,發(fā)現(xiàn)乙酸葉醇酯能在短時低溫處理時顯著誘導(dǎo)CsLOX3的表達;過夜低溫處理時CsADH1和CsADH3的相對表達量也增加。GLVs可以通過反向調(diào)節(jié)自身合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達,促進綠葉揮發(fā)物和茉莉酸等激素的合成,進一步增強茶樹抗性[16]。乙酸葉醇酯使短時低溫處理時CsICE1、CsICE2、CsCBF1、CsCBF5基因的表達被誘導(dǎo);低溫過夜處理時,CsRD1和CsRD2基因的表達量增加,而CsCBF1~CsCBF5基因的表達量降低。這可能與CBF基因和RD基因響應(yīng)冷脅迫順序有關(guān),CBF在低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中位于上游環(huán)節(jié),響應(yīng)冷脅迫迅速;RD基因在下游環(huán)節(jié),響應(yīng)冷脅迫時間較長[26-27]。CBF基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在低溫脅迫下15 min后迅速積累,2 h含量達到最高水平后逐漸下降,而COR(RD)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物才開始積累[10]。

    SOD、POD和CAT是細胞抗氧化酶的重要組成部分,能夠在植物受到非生物脅迫時清除細胞內(nèi)的自由氧,維持植物體內(nèi)的活性氧代謝平衡,緩解自由氧對細胞的傷害[28]。本試驗中外源乙酸葉醇酯的施用顯著提高了低溫過夜處理下茶樹葉片SOD、POD和CAT的酶活性。此外,外源乙酸葉醇酯的施用還會影響茶樹葉片的理化成分,增加了低溫脅迫下茶樹體內(nèi)GC、ECG和CG的含量,降低了咖啡堿含量。

    本試驗結(jié)果表明,乙酸葉醇酯在短時低溫(4 ℃,1.5 h)和低溫過夜處理(4 ℃,16 h)中可通過提高自身合成基因CsADH1、CsADH3和CsLOX3的表達量;促進冷誘導(dǎo)基因CsICE1、CsICE2、CsCBF1~CsCBF5、CsRD1和CsRD2按冷信號傳導(dǎo)順序表達;增強SOD、POD和CAT酶活性等方式提高茶樹的抗寒性。

    參考文獻:

    [1]尹皓嬋,李莉莉,宋宛霖,等. 茶樹抗寒機理及其應(yīng)用的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2019,47(4):22-25.

    [2]時 慧,王 玉,周克福,等. 低溫脅迫下茶樹葉片活性氧代謝及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化規(guī)律[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,44(7):22-25.

    [3]郝心愿,王 璐,曾建明,等. 低溫凍害對茶樹生理的影響及應(yīng)對技術(shù)[J]. 中國茶葉,2020,42(5):13-16.

    [4]林鄭和,鐘秋生,游小妹,等. 低溫脅迫對茶樹抗氧化酶活性的影響[J]. 茶葉科學(xué),2018,38(4):363-371.

    [5]李葉云,龐 磊,陳啟文,等. 低溫脅迫對茶樹葉片生理特性的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,40(4):134-138,145.

    [6]王 郁. 茶樹低溫應(yīng)答相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CsICE1和CsCBF1的研究[D]. 合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2011:37-42.

    [7]Gong Z Z,Xiong L M,Shi H Z,et al. Plant abiotic stress response and nutrient use efficiency[J]. Science China(Life Sciences),2020,63(5):635-674.

    [8]Yin Y,Ma Q P,Zhu Z X,et al. Functional analysis of CsCBF3 transcription factor in tea plant (Camellia sinensis) under cold stress[J]. Plant Growth Regulation,2016,80(3):335-343.

    [9]Wang P J,Chen X J,Guo Y C,et al. Identification of CBF transcription factors in tea plants and a survey of potential CBF target genes under low temperature[J]. International Journal of Molecular Sciences,2019,20(20):5137.

    [10]劉東曉. 茶樹CsCBF2轉(zhuǎn)基因煙草的非生物脅迫耐受性分析[D]. 信陽:信陽師范學(xué)院,2017.

    [11]黃永會,劉永翔,朱 英,等. COR基因在植物抗寒基因工程中的作用[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(12):37-42.

    [12]陳書霞,陳 巧,王聰穎,等. 綠葉揮發(fā)物代謝調(diào)控及分子機理研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(8):1545-1557.

    [13]Bai J H,Baldwin E A,Imahori Y,et al. Chilling and heating may regulate C6 volatile aroma production by different mechanisms in tomato (Solanum lycopersicum) fruit[J]. Postharvest Biology and Technology,2011,60(2):111-120.

    [14]謝鑫鑫,林碧英,林忠平.綠葉揮發(fā)物合成相關(guān)基因及其生理生態(tài)功能[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究,2014,10(4):279-284.

    [15]Sun H F,Li Z Y,Wu B,et al. Review of recent advances on the production and eco-physiological roles of green leaf volatiles[J]. Chinese Journal of Plant Ecology,2013,37(3):268-275.

    [16]Hu S L,Chen Q H,Guo F,et al. (Z)-3-Hexen-1-ol accumulation enhances hyperosmotic stress tolerance in Camellia sinensis[J]. Plant Molecular Biology,2020,103(3):287-302.

    [17]Wang L,Baldwin E,Luo W,et al. Key tomato volatile compounds during postharvest ripening in response to chilling and pre-chilling heat treatments[J]. Postharvest Biology and Technology,2019,154:11-20.

    [18]胡雙玲.綠葉揮發(fā)物和組蛋白H3K4甲基化在茶樹干旱脅迫響應(yīng)中的功能研究[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2019:37.

    [19]Yamauchi Y,Matsuda A,Matsuura N,et al. Transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana treated with green leaf volatiles:possible role of green leaf volatiles as self-made damage-associated molecular patterns[J]. Journal of Pesticide Science,2018,43(3):207-213.

    [20]Ju L J,Zhang C,Liao J J,et al. An oriental melon 9-lipoxygenase gene CmLOX09 response to stresses,hormones,and signal substances[J]. Journal of Zhejiang University.Science.B,2018,19(8):596-609.

    [21]Shen J Z,Zou Z W,Xing H Q,et al. Genome-wide analysis reveals stress and hormone responsive patterns of JAZ family genes in Camellia sinensis[J]. International Journal of Molecular Sciences,2020,21(7):2433.

    [22]朱小佩.茶樹CBF基因的克隆與功能分析[D]. 信陽:信陽師范學(xué)院,2011:44.

    [23]尹 盈.茶樹低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子CsICE和CsCBF的亞細胞定位、表達分析及功能驗證[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2013:73.

    [24]Wang Y,Jiang C J,Li Y Y,et al. CsICE1 and CsCBF1:two transcription factors involved in cold responses in Camellia sinensis[J]. Plant Cell Reports,2012,31(1):27-34.

    [25]王智煜,李迎迎,胡雅倩,等. 四分體期低溫脅迫對2個小麥品種幼穗結(jié)實率及生理特性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2019,47(10):114-116.

    [26]Chinnusamy V,Ohta M,Kanrar S,et al. ICE1:a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis[J]. Genes & Development,2003,17(8):1043-1054.

    [27]Zhao C Z,Lang Z B,Zhu J K.Cold responsive gene transcription becomes more complex[J]. Trends in Plant Science,2015,20(8):466-468.

    [28]Gill S S,Tuteja N.Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry,2010,48(12):909-930.

    猜你喜歡
    耐寒性低溫脅迫茶樹
    山茶樹變身搖錢樹
    根據(jù)萌發(fā)率和出苗率篩選高粱種子萌發(fā)期耐低溫材料
    遮陽網(wǎng)覆蓋對枇杷幼果抗寒性影響機理初探
    甜玉米自交系萌芽期耐寒性的鑒定和篩選(內(nèi)文第22~26頁)圖版
    兩個推薦茶樹品種
    茶樹灣
    美洲斑潛蠅蛹的耐寒性研究
    轉(zhuǎn)ICE1基因水稻耐冷性與膜脂過氧化和抗氧化酶活性的關(guān)系
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)(2015年8期)2015-09-10 14:49:14
    4個早稻品種苗期低溫脅迫的耐寒性比較
    作物研究(2014年6期)2014-03-01 03:38:59
    中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 免费看不卡的av| 蜜桃在线观看..| 免费观看av网站的网址| 国产麻豆69| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| av不卡在线播放| 熟妇人妻不卡中文字幕| 九草在线视频观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 热re99久久国产66热| 一级黄片播放器| 久久久a久久爽久久v久久| 看免费成人av毛片| 满18在线观看网站| 捣出白浆h1v1| 三级国产精品片| 在线观看www视频免费| 国产在线一区二区三区精| 日本欧美视频一区| 黄片小视频在线播放| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美+日韩+精品| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 成人影院久久| 黄色怎么调成土黄色| 丰满迷人的少妇在线观看| 好男人视频免费观看在线| 不卡av一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 国产成人欧美| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 中文字幕制服av| 高清在线视频一区二区三区| av在线老鸭窝| 久热这里只有精品99| 精品一品国产午夜福利视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 免费黄色在线免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 天堂中文最新版在线下载| 欧美成人午夜精品| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 丝袜在线中文字幕| 99久国产av精品国产电影| 亚洲 欧美一区二区三区| 一级毛片 在线播放| 伊人亚洲综合成人网| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧洲日产国产| 久久精品夜色国产| 欧美激情 高清一区二区三区| freevideosex欧美| 综合色丁香网| 亚洲图色成人| 国产有黄有色有爽视频| 2018国产大陆天天弄谢| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 蜜桃在线观看..| av在线观看视频网站免费| 国产片内射在线| 少妇 在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产亚洲欧美精品永久| 搡老乐熟女国产| 国产1区2区3区精品| av女优亚洲男人天堂| 美女视频免费永久观看网站| 一级爰片在线观看| 欧美人与善性xxx| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品一国产av| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 毛片一级片免费看久久久久| 欧美成人午夜精品| 亚洲图色成人| 久久久欧美国产精品| 成人免费观看视频高清| 永久免费av网站大全| 日韩伦理黄色片| 国产亚洲最大av| 在现免费观看毛片| 91成人精品电影| 18禁国产床啪视频网站| 黄色一级大片看看| 午夜福利在线免费观看网站| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲成人av在线免费| 男人操女人黄网站| 国产男女内射视频| 欧美国产精品一级二级三级| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 男男h啪啪无遮挡| 高清在线视频一区二区三区| 久久免费观看电影| 久久精品久久精品一区二区三区| 午夜福利视频在线观看免费| a级毛片在线看网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 韩国精品一区二区三区| 人体艺术视频欧美日本| 97在线视频观看| 国产乱来视频区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日本午夜av视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 精品亚洲成国产av| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 999精品在线视频| 岛国毛片在线播放| 777米奇影视久久| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 五月伊人婷婷丁香| 超碰成人久久| 国产精品不卡视频一区二区| 精品国产一区二区久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 99国产精品免费福利视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久午夜福利片| 97在线人人人人妻| 伦理电影大哥的女人| 丝袜人妻中文字幕| 日日撸夜夜添| 爱豆传媒免费全集在线观看| xxx大片免费视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 一级黄片播放器| 欧美av亚洲av综合av国产av | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 午夜免费观看性视频| 国产在线视频一区二区| 亚洲精品自拍成人| 成人黄色视频免费在线看| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久av网站| 免费高清在线观看视频在线观看| 丰满乱子伦码专区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 热re99久久精品国产66热6| 欧美+日韩+精品| 亚洲美女黄色视频免费看| 日本av手机在线免费观看| 青春草国产在线视频| 免费看av在线观看网站| 国产伦理片在线播放av一区| 天天操日日干夜夜撸| www.精华液| 欧美日韩精品网址| 1024香蕉在线观看| 亚洲精品视频女| 久久影院123| 亚洲av综合色区一区| 99国产精品免费福利视频| 18在线观看网站| 久久影院123| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久久久久人妻| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 日韩三级伦理在线观看| 精品久久久精品久久久| av在线老鸭窝| 国产av码专区亚洲av| 欧美日韩精品成人综合77777| xxxhd国产人妻xxx| 中文字幕亚洲精品专区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日本av免费视频播放| 国产综合精华液| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲第一青青草原| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久ye,这里只有精品| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美日本中文国产一区发布| av福利片在线| 各种免费的搞黄视频| 大片电影免费在线观看免费| 一级a爱视频在线免费观看| 久久这里有精品视频免费| 美女大奶头黄色视频| av一本久久久久| 欧美成人午夜精品| 精品酒店卫生间| 视频区图区小说| av电影中文网址| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 日韩不卡一区二区三区视频在线| 我的亚洲天堂| 一级a爱视频在线免费观看| 国产不卡av网站在线观看| 只有这里有精品99| 一级片'在线观看视频| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲精品一二三| 久久99精品国语久久久| 国产男女内射视频| 国产在视频线精品| tube8黄色片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 高清欧美精品videossex| 日本91视频免费播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 边亲边吃奶的免费视频| 少妇的丰满在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 午夜福利一区二区在线看| 欧美日韩成人在线一区二区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 最近中文字幕高清免费大全6| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 如何舔出高潮| 国产精品国产av在线观看| 两性夫妻黄色片| 日日爽夜夜爽网站| 韩国高清视频一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久99精品国语久久久| 91久久精品国产一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 考比视频在线观看| 国产av精品麻豆| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 在线 av 中文字幕| 99久久人妻综合| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩精品有码人妻一区| 麻豆乱淫一区二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 男男h啪啪无遮挡| 蜜桃在线观看..| 亚洲成国产人片在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 男的添女的下面高潮视频| 9191精品国产免费久久| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲欧洲日产国产| 国产xxxxx性猛交| 婷婷色综合大香蕉| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲av电影在线进入| 国产亚洲最大av| 国产一区有黄有色的免费视频| 观看av在线不卡| a 毛片基地| 久久国产精品大桥未久av| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲国产看品久久| 中文字幕色久视频| 91成人精品电影| 最黄视频免费看| 一级a爱视频在线免费观看| 国产av码专区亚洲av| 一区二区三区四区激情视频| 欧美人与善性xxx| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久精品国产自在天天线| 久久人人爽人人片av| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 久久97久久精品| 1024香蕉在线观看| 午夜激情久久久久久久| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲美女黄色视频免费看| 午夜激情av网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看| av国产精品久久久久影院| 久热这里只有精品99| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 美女午夜性视频免费| 久久这里只有精品19| 亚洲精品在线美女| av网站免费在线观看视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 99re6热这里在线精品视频| www.精华液| 一个人免费看片子| 美女国产视频在线观看| 日日啪夜夜爽| 性少妇av在线| 亚洲国产精品国产精品| 久久这里只有精品19| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久免费观看电影| 狂野欧美激情性bbbbbb| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 99久久综合免费| 国产欧美亚洲国产| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品不卡视频一区二区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 1024香蕉在线观看| 制服人妻中文乱码| 日韩在线高清观看一区二区三区| 精品一区在线观看国产| 两个人免费观看高清视频| 精品久久蜜臀av无| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 人人妻人人澡人人看| 妹子高潮喷水视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 一级黄片播放器| 老鸭窝网址在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲精品日本国产第一区| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品国产av成人精品| 夫妻性生交免费视频一级片| 大片免费播放器 马上看| 岛国毛片在线播放| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 人人澡人人妻人| 宅男免费午夜| 青春草亚洲视频在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 国产激情久久老熟女| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品人妻久久久影院| 精品久久蜜臀av无| 婷婷成人精品国产| 丝袜美腿诱惑在线| 精品第一国产精品| 丁香六月天网| 婷婷色麻豆天堂久久| 99九九在线精品视频| 免费看不卡的av| 国产97色在线日韩免费| 妹子高潮喷水视频| 永久免费av网站大全| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩伦理黄色片| 久久人人爽人人片av| av.在线天堂| 我的亚洲天堂| 国产淫语在线视频| 欧美bdsm另类| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久午夜福利片| 久久女婷五月综合色啪小说| av国产久精品久网站免费入址| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品久久久久久av不卡| 午夜福利在线免费观看网站| 最近手机中文字幕大全| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 青草久久国产| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产成人精品一,二区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 高清欧美精品videossex| 宅男免费午夜| 国产精品成人在线| 国产精品一区二区在线不卡| 老熟女久久久| 91国产中文字幕| 亚洲综合精品二区| 91精品三级在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美bdsm另类| 伊人久久国产一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 一级爰片在线观看| 欧美另类一区| 尾随美女入室| 免费观看无遮挡的男女| 叶爱在线成人免费视频播放| 热99国产精品久久久久久7| 久久99一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 卡戴珊不雅视频在线播放| 一级爰片在线观看| 街头女战士在线观看网站| 婷婷色综合www| 不卡视频在线观看欧美| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品二区激情视频| 高清不卡的av网站| 69精品国产乱码久久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美在线黄色| 搡老乐熟女国产| 91精品三级在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久久久精品性色| 亚洲人成电影观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲国产av新网站| 日韩视频在线欧美| 久久ye,这里只有精品| 99re6热这里在线精品视频| 国产免费视频播放在线视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产极品天堂在线| 人妻少妇偷人精品九色| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲成人手机| 国产欧美亚洲国产| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 看免费成人av毛片| 亚洲情色 制服丝袜| 国产又色又爽无遮挡免| 国产一区二区在线观看av| 性色av一级| 美女大奶头黄色视频| 一本久久精品| 亚洲成色77777| 日本av手机在线免费观看| 午夜福利,免费看| 免费观看无遮挡的男女| 天堂中文最新版在线下载| 一二三四在线观看免费中文在| 两性夫妻黄色片| www.自偷自拍.com| 久久这里只有精品19| 纯流量卡能插随身wifi吗| 2022亚洲国产成人精品| 老司机影院成人| 国产一区二区三区综合在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲伊人色综图| 日本色播在线视频| 一区二区三区激情视频| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品第二区| 99香蕉大伊视频| 老女人水多毛片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 好男人视频免费观看在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品三级大全| 少妇被粗大猛烈的视频| 青春草国产在线视频| 久久免费观看电影| 热99国产精品久久久久久7| 国产av精品麻豆| 日日摸夜夜添夜夜爱| 捣出白浆h1v1| 黄色怎么调成土黄色| 人妻 亚洲 视频| 亚洲国产av影院在线观看| 免费看av在线观看网站| 青草久久国产| 亚洲三区欧美一区| 1024视频免费在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美人与性动交α欧美软件| 成年美女黄网站色视频大全免费| 丝袜美足系列| 亚洲在久久综合| 中国国产av一级| 免费看不卡的av| 国产精品免费大片| 在线观看一区二区三区激情| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 三级国产精品片| 亚洲av国产av综合av卡| 久久久久精品性色| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 高清欧美精品videossex| 亚洲欧美精品自产自拍| 在现免费观看毛片| 国产成人精品无人区| a 毛片基地| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美日韩成人在线一区二区| 999精品在线视频| 精品国产一区二区久久| 丝袜喷水一区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 在线观看免费视频网站a站| 久久久精品94久久精品| 尾随美女入室| av在线播放精品| 亚洲经典国产精华液单| 日韩欧美精品免费久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 9热在线视频观看99| 母亲3免费完整高清在线观看 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲三级黄色毛片| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 18+在线观看网站| 国产综合精华液| 国产欧美亚洲国产| 亚洲国产最新在线播放| 在线看a的网站| 欧美日韩精品网址| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 天堂俺去俺来也www色官网| 青草久久国产| 久久久久久久国产电影| 久久久久久伊人网av| 亚洲三级黄色毛片| 国产亚洲最大av| 捣出白浆h1v1| 午夜福利视频精品| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲国产欧美在线一区| www.av在线官网国产| av女优亚洲男人天堂| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| av在线观看视频网站免费| 丁香六月天网| 观看美女的网站| 久久99一区二区三区| 中文字幕制服av| 多毛熟女@视频| 久久久久久久久久久免费av| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产成人91sexporn| kizo精华| 亚洲欧美清纯卡通| 一区在线观看完整版| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 卡戴珊不雅视频在线播放| 麻豆av在线久日| videos熟女内射| 久久热在线av| 亚洲av日韩在线播放| 18禁观看日本| 男女高潮啪啪啪动态图| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 妹子高潮喷水视频| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲成色77777| 国产乱来视频区| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 看免费成人av毛片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 人人妻人人澡人人看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜av观看不卡| 日本91视频免费播放| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久久久久久久久大奶| 国产在线一区二区三区精| 两个人看的免费小视频| 大话2 男鬼变身卡| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美xxⅹ黑人| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 永久网站在线| 999久久久国产精品视频| 欧美精品av麻豆av| 日本免费在线观看一区| 国产精品久久久久久久久免| 欧美少妇被猛烈插入视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 黄色 视频免费看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久精品94久久精品| av.在线天堂| 久久久久久人妻| 黑人欧美特级aaaaaa片| 天天操日日干夜夜撸| 97在线人人人人妻| 免费观看性生交大片5| 一级,二级,三级黄色视频| 少妇精品久久久久久久| 午夜福利视频精品| 欧美精品一区二区免费开放| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 国产一区二区激情短视频 |