庫(kù)爾勒香梨果實(shí)香氣代謝過(guò)程中相關(guān)酶類活性變化研究

張 軍，姚 虹

(鄭州工程技術(shù)學(xué)院 a.化工食品學(xué)院; b.分析檢測(cè)中心，河南 鄭州 450044)

梨(Pyrusspp.Rosaceae)果實(shí)具有獨(dú)特的香氣，是構(gòu)成梨的品質(zhì)特征的重要因素[1]。香氣物質(zhì)是在植物生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)形成的各種揮發(fā)性化合物[1-2]，是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其前體物質(zhì)為碳水化合物、脂肪酸、氨基酸。果實(shí)香氣的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程,不同發(fā)育階段果實(shí)中的關(guān)鍵酶活性不同，所產(chǎn)生的香氣物質(zhì)也不同。一般在果實(shí)中香氣物質(zhì)分子可以分為有機(jī)酸脂類、醛類、醇、酮、揮發(fā)性萜類雜環(huán)類化合物等[3]。對(duì)果實(shí)香氣特征貢獻(xiàn)大的香氣物質(zhì)稱為果實(shí)特征香氣物質(zhì)，即能使果實(shí)呈現(xiàn)特有香味的一類揮發(fā)性物質(zhì)[4]。各種揮發(fā)性香氣小分子來(lái)源路徑各不相同[5]。

脂氧合酶(LOX)途徑形成大量的直鏈脂肪族醇、醛、酮和酯類物質(zhì)[6]。果實(shí)中大量不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸)被專一的、高活性脂氧合酶氧化產(chǎn)生一系列小分子醇、酸等，構(gòu)成了果實(shí)脂類香氣的主體，還參與了C6己醛和己烯醛的合成[7]，這些化合物對(duì)果蔬的“新鮮”風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)[8]，如柑橘中的(E)-3-己烯醇和己醛[9-10]。番茄在不同的成長(zhǎng)階段有特征的揮發(fā)性香氣成分物質(zhì)，成熟時(shí)有以C6分子的己醇、己醛、(Z)-3-己烯醛等為特征的新鮮風(fēng)味物質(zhì)[11]。不飽和脂肪酸經(jīng)脂氧合酶途徑生成氫過(guò)氧化物，逐步經(jīng)過(guò)氧化、裂解及脫氫作用轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醛類和醇類，進(jìn)一步形成酯類等。LOX是脂肪酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在香氣物質(zhì)形成過(guò)程中醇脫氫酶(ADH)、醇酰基轉(zhuǎn)移酶(AAT)等也起到重要作用[12]。

醇酰基轉(zhuǎn)移酶(AAT)是氨基酸代謝途徑產(chǎn)生支鏈脂肪族醇、醛、酮和酯類物質(zhì)的關(guān)鍵限速酶。果實(shí)中有部分氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，通過(guò)氨基轉(zhuǎn)移作用形成了支鏈酮酸，支鏈酮酸與輔酶A(Co-AS)作用生成了酰基Co-AS，然后在AAT的作用下生成酯[13]。該途徑參與香氣小分子代謝合成的氨基酸主要有丙氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸和亮氨酸等。AAT是氨基酸代謝途徑酯類形成過(guò)程中的關(guān)鍵酶[14]，它催化?；o酶A中的?；⑥D(zhuǎn)到相應(yīng)的醇，為下一步酯類合成準(zhǔn)備了充足的原料。其中丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸為甲基支鏈酯合成的前體物質(zhì)。部分果實(shí)中的酯香型、果香型特征香氣成分是通過(guò)氨基酸代謝途徑產(chǎn)生的，如柑橘[15]。

醇脫氫酶(ADH)在LOX途徑中主要依賴NAD, 廣泛參與直鏈醛、支鏈醛、芳香醛等與對(duì)應(yīng)醇之間的轉(zhuǎn)化，是植物香氣物質(zhì)合成中最重要的酶。在氨基酸代謝中，氨基酸在脫羧酶作用下生成醛，然后在醇脫氫酶的作用下生成酸。另外，單糖經(jīng)無(wú)氧代謝產(chǎn)生丙酮酸，在ADH作用下氧化脫羧形成乙酰輔酶A,進(jìn)而合成某酸乙酯或乙酸某酯等[16]。

β-葡萄糖苷酶(CB)作用下的鍵合態(tài)香氣也是水果香氣的重要組成部分，作為一種潛香型化合物，與植物中的糖類物質(zhì)通過(guò)糖苷鍵結(jié)合形式存在于植物中，一般是β-D-葡萄糖[17]，不具揮發(fā)性，在酸或酶的作用下水解釋放后，從水果中揮發(fā)出來(lái)，可以被人們感受到，這種相對(duì)直接被人們感受到的香氣就是自由態(tài)香氣[18]。目前有人研究認(rèn)為，鍵合態(tài)香氣的數(shù)量和種類在個(gè)別水果中遠(yuǎn)高于自由態(tài)香氣[19]，它們共同作用，構(gòu)成了水果的基本風(fēng)味和特征香氣[20]。因此，β-糖苷酶作為外源的水解酶，已被廣泛確認(rèn)能夠水解植物中的鍵合態(tài)香氣的糖苷鍵，使香氣得到釋放[21]。

庫(kù)爾勒香梨以獨(dú)特而濃郁的香味著名，怡人的果實(shí)香氣可以吸引消費(fèi)者并增強(qiáng)果品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。近年來(lái)，人們對(duì)果品香氣及貯藏過(guò)程中內(nèi)容物質(zhì)變化越來(lái)越關(guān)注，但對(duì)庫(kù)爾勒香梨果實(shí)香氣的形成和衰減生理機(jī)制的研究分析很少，尤其是對(duì)庫(kù)爾勒香梨香氣成分與相關(guān)酶的相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道。以庫(kù)爾勒香梨為試驗(yàn)材料，對(duì)其揮發(fā)性香氣相關(guān)酶活性進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在闡明庫(kù)爾勒香梨果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)代謝調(diào)控機(jī)理，也為今后新疆梨品種選育、栽培管理、采后貯藏、果實(shí)品質(zhì)改善等技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來(lái)自新疆庫(kù)爾勒沙依東園藝場(chǎng)梨園(北緯41°43′56″，東經(jīng)86°1′59″；北緯41°43′17″，東經(jīng)86°2′18″)，25年左右樹齡香梨樹(間種授粉樹為碭山梨)，采樣時(shí)間選在中午(1200～1400)進(jìn)行，選擇生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的庫(kù)爾勒香梨植株果實(shí)。每隔30天左右采樣一次，冰盒冰鮮運(yùn)至昌吉市實(shí)驗(yàn)室，放置于-80℃冰箱超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、正丁醇、鹽酸、氯化鎂、乙醛、檸檬酸、石英砂：均為分析純，天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；亞油酸、Tween 20、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、TritonX-100、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、對(duì)硝基苯基-β-葡萄糖苷(pNPG)、對(duì)硝基苯酚(PNP)、2-嗎啉乙磺酸(MES)、二硫蘇糖醇(DTT)：上海麥克林生化科技有限公司；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、乙酰-CoA：羅氏(中國(guó))有限公司；水：色譜純。

UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津公司；BS210S電子天平：德國(guó)Sartorius 公司；冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；HHS-1電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；W-HL328超低溫冰箱：中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；GL-4L冷藏保溫箱：廣州佳冷冷藏科技有限公司；移液器：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司；10 L液氮罐：查特生物醫(yī)療(成都)有限公司。

采用 Excel 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析，使用 origin 9.0 作圖。

1.3 不同時(shí)期庫(kù)爾勒香梨果實(shí)中LOX酶活性測(cè)定

參照詹萍[22]，Liburdi[23]等方法并做適當(dāng)修改。

反應(yīng)底物：在溶有0.1 g Tween 20重蒸水中加入50 μL亞油酸，用NaOH溶液(1 mol/L)滴定至澄清，調(diào)節(jié)pH在9.0左右，用重蒸水定容至25 mL，冷藏備用。

粗酶液提?。悍Q取10.0 g庫(kù)爾勒香梨，立即在液氮下研磨成粉末，加入1.0 g PVP，5 mL預(yù)冷的0.005 mol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 7.0)，5mL TritonX-100(1% )，冰浴環(huán)境研磨成勻漿， 在0℃下于7000 r/min離心30 min，上清液在4 ℃下于7400 r/min離心15 min，取出上清液，并用相應(yīng)的緩沖液定容至10 mL，即得粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆?-30℃冰箱保存)。

LOX酶活性測(cè)定：酶反應(yīng)體系為3 mL，包括2.88 mL pH 7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(0.05 mol/L)，0.1 mL亞油酸反應(yīng)底物和0.02 mL酶液。反應(yīng)體系加入酶液后倒轉(zhuǎn)3次(15 s左右)，于室溫下在波長(zhǎng)234 nm處測(cè)定吸光度的變化值，即ΔOD234(每隔20 s記錄一次吸光值，共記錄3 min)。酶活力以每分鐘吸光值變化0.001為一個(gè)活性單位。

空白對(duì)照：按上述方法處理加熱失活的粗酶液,作為空白對(duì)照。

1.4 不同時(shí)期庫(kù)爾勒香梨果實(shí)中ATT酶活性測(cè)定

本方法參照Fellman[24]，張曉萌[25]等并做適當(dāng)修改，稍加改進(jìn)。

反應(yīng)底物：10mmol/L正丁醇。

粗酶液的提取：取3 g果肉，加0.1 g PVPP和6 mL 0.1mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)，在冰浴環(huán)境充分研磨成勻漿，在4℃下于16000 r/min離心30 min，上清液用于酶活性的測(cè)定。

酶活性測(cè)定：反應(yīng)體系由2.4 mL的0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.0)，11.6 mmol/L MgCl2，0.3 mmol/L 乙酰-CoA，10 mmol/L 正丁醇和0.6 mL酶液組成。各組分混合后置于 35℃水浴15 min，然后添加150 μL 10 mmol/L DTNB，在室溫下放置10 min，用紫外分光光度計(jì)在412 nm下測(cè)定吸光值，重復(fù)3次。酶活性以ΔOD412表示，酶活力以每分鐘吸光值變化0.001為一個(gè)活性單位。

空白對(duì)照：按上述方法處理加熱失活的粗酶液，作為空白對(duì)照。

1.5 不同時(shí)期庫(kù)爾勒香梨果實(shí)中醇脫氫酶ADH活性測(cè)定

本方法參照Longhurst T J[26]，A Echeverría G[27]等方法，做適當(dāng)修改并改進(jìn)。

反應(yīng)底物：0.15mL的0.08 mol/L乙醛。

粗酶液的提取：取3.0 g果肉冷凍組織，液氮充分研磨呈粉末狀，加入6 mL經(jīng)預(yù)冷(4℃)的提取液，組成如下：0.1 mol/L MES-Tris緩沖液(pH 6.5)，2mmol/L DTT，1% PVP。充分混勻、浸提，4℃下于15000 r/min離心30 min，上清液用于ADH活性測(cè)定。

酶活性測(cè)定：3 mL反應(yīng)體系由2.4 mL的MES-Tris緩沖液(pH 6.5)，0.15 mL的l.6 mmol/L NADH，0.15 mL的0.08 mol/L乙醛和0.3 mL的粗酶液組成，反應(yīng)溫度為30℃，于340 nm下測(cè)定ADH活性。加酶液后15 s開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄1min內(nèi)吸光度OD值變化，重復(fù)3次。酶活力以每分鐘吸光值變化0.001為一個(gè)活性單位。

空白對(duì)照：按上述方法處理加熱失活的粗酶液，作為空白對(duì)照。

1.6 不同時(shí)期庫(kù)爾勒香梨果實(shí)中β-葡萄糖苷酶CB活性測(cè)定

本方法參照詹萍[28]、李華[29]等方法，做適當(dāng)修改并稍加改進(jìn)。

粗酶液提?。悍Q取10.0 g庫(kù)爾勒香梨，立即在液氮下研磨成粉末，加入1.0 g PVP，0.2 g 石英砂，5 mL預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 6.0)，冰浴環(huán)境研磨成勻漿，4℃下于10000 r/min 離心20 min ，上清液4℃下于14400 r/min 離心10 min，取出上清液，并用緩沖液定容至10 mL，得粗酶液。其余保存在-30℃冰箱中備用。

活性測(cè)定：在10 mL具塞試管中依次加入0.6 mL 緩沖液、1.0 mL 粗酶提取液和 0.2 mL 10 mmol對(duì)硝基苯基-β-葡萄糖苷，迅速蓋上試管塞，立即放至35℃水浴中，反應(yīng)60 min后立即加入 2.5 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在對(duì)硝基苯酚的最佳吸收波長(zhǎng)400 nm處測(cè)吸光值。

空白對(duì)照：0.2 mL的10 mmol pNPG用0.2 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH6)代替酶粗提液，其他同上。

對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱量對(duì)PNP(WM139.1)139.0 mg，用蒸餾水定容至1 L。分別吸取1，2，3，4，5，6 mL溶液至100 mL容量瓶中，用l mol/L Na2CO3溶液定容后混勻。使1 mL稀釋液中分別含有對(duì)硝基苯酚0.01，0.03，0.05 μmol，利用對(duì)硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出所生成的對(duì)硝基苯酚的濃度。

2 結(jié)果與分析

果實(shí)香氣是果實(shí)性狀之一，性狀的產(chǎn)生和表現(xiàn)受到各種酶的控制[30]。本研究選擇的果實(shí)香氣合成代謝的4種關(guān)鍵酶類，即LOX，ATT，ADH和CB在庫(kù)爾勒香梨香氣合成代謝過(guò)程中活性變化各有特點(diǎn)，具體說(shuō)明如下。

2.1 庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同時(shí)期脂氧合酶LOX活性變化

LOX途徑是果實(shí)香氣脂肪酸代謝途徑初始過(guò)程中重要的限速酶，決定LOX途徑的順利進(jìn)行，為后續(xù)的轉(zhuǎn)化過(guò)程提供底物，它與植物的器官發(fā)育及果實(shí)成熟有很大關(guān)系[31]。

由圖1上可見(jiàn)，庫(kù)爾勒香梨果實(shí)從花后1個(gè)月左右LOX酶活力為ΔOD2340.0094g-1·min-1，開(kāi)始緩慢增加，在7月份猛然到達(dá)最大ΔOD2340.0724g-1·min-1，然后LOX酶活性開(kāi)始下降。從活性變化趨勢(shì)線上看總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與果實(shí)中LOX作用底物有關(guān)[32]，在植物膜脂中富含的亞油酸和亞麻酸是其主要的反應(yīng)底物[33]。在香梨成熟采摘后10月份至12月份活性一直平緩下降。

圖1 香梨果實(shí)不同時(shí)期LOX酶活性變化

2.2 庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同時(shí)期ATT活性

在香梨發(fā)育及其貨架期，ATT的活性變化總體趨勢(shì)傾斜向上，與ATT活性變化趨勢(shì)走向相反，但是從走勢(shì)圖上看，變化總體上與LOX活性變化相類似。AAT是催化LOX酯類合成的最后一步，是參與酯類途徑中的最終限速酶，是氨基酸代謝的關(guān)鍵酶，它可以催化醇類底物與?；?CoA 酯化為相應(yīng)的酯類物質(zhì)[34]，從而生成果實(shí)酯類香氣成分中的特征香氣。

由圖2可見(jiàn)，香梨果實(shí)從花后1個(gè)月左右ATT活力為ΔOD4120.012g-1·min-1，6月份稍微緩慢降低至ΔOD4120.0102g-1·min-1，然后開(kāi)始抬升，至9月份到達(dá)最大ΔOD4120.0227g-1·min-1，然后到達(dá)10月份ATT活性開(kāi)始平緩下降至12月份。在香梨果實(shí)發(fā)育前期活性變化不穩(wěn)定，但隨著果實(shí)成熟逐漸升高隨后下降至平緩。

圖2 香梨果實(shí)不同時(shí)期ATT酶活性變化

2.3 庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同時(shí)期ADH活性

香梨果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，ADH活性變化較大。參與植物體內(nèi)各種醇類與相應(yīng)醛類物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)[35]。從圖3可見(jiàn)，ADH活性從香梨果實(shí)花后1個(gè)月左右從最低點(diǎn)ΔOD3400.0029g-1·min-1開(kāi)始劇烈增高，7月份達(dá)ΔOD3400.0346g-1·min-1后開(kāi)始緩慢下降。8月份至10月份ADH酶活降低較為平緩，從ΔOD3400.0280g-1·min-1緩慢降至ΔOD3400.0256g-1·min-1，從香梨生理上說(shuō)，這段時(shí)間香梨開(kāi)始成熟，果園一般9月份至10月份開(kāi)始采摘。ADH酶活平穩(wěn)，說(shuō)明在香梨果實(shí)內(nèi)香氣的LOX途徑、氨基酸途徑和糖代謝途徑生化反應(yīng)進(jìn)行平穩(wěn)，合成和代謝進(jìn)入平臺(tái)期。此后香梨果實(shí)ADH活性又降低迅速，11月份降至ΔOD3400.0129g-1·min-1，繼續(xù)降低至12月份ΔOD3400.0107g-1·min-1。

圖3 香梨果實(shí)不同時(shí)期ADH酶活性變化

2.4 庫(kù)爾勒香梨果實(shí)不同時(shí)期CB活性

研究CB，即研究β-葡萄糖苷酶活性，目的在于分析和尋找鍵合態(tài)香氣產(chǎn)生的機(jī)理及其與自由態(tài)香氣的關(guān)系。植物中多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的糖基化復(fù)合物，相對(duì)應(yīng)的，植物中必然存在著能夠催化這些次級(jí)代謝產(chǎn)物糖苷的葡萄糖苷酶[36]。因此實(shí)驗(yàn)以對(duì)硝基苯酚做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.05253x-0.0003，相關(guān)系數(shù)R2=0.99989，考察β-糖苷酶的活性，說(shuō)明相關(guān)性極好。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)香梨坐果1個(gè)月后(5月中旬)的CB活性為ΔOD4000.1705g-1·min-1，變化如圖4所示繼續(xù)升高，在6月中旬達(dá)到ΔOD4000.1990g-1·min-1，從整個(gè)動(dòng)態(tài)圖上看6月份β-葡萄糖苷酶活性最高，并且以此為拐點(diǎn)開(kāi)始下降，8月份降至ΔOD4000.044g-1·min-1，此后下降趨勢(shì)平緩，從8月份到11月份的變化很小。至貨架期12月份則降至ΔOD4000.014g-1·min-1。香梨果實(shí)整個(gè)發(fā)育生長(zhǎng)階段以致貨架期(保存3個(gè)月，10月中旬采收，12月中旬最后一次檢測(cè))β-葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在果實(shí)膨大期(6月份)達(dá)到最大，隨后開(kāi)始持續(xù)下降。 總體趨勢(shì)與前人對(duì)京白梨研究一致[31]。但有些許差異，有待進(jìn)一步考證。

圖4 香梨果實(shí)不同時(shí)期CB酶活性變化

3 討論

一切生命活動(dòng)都是在酶的參與下進(jìn)行的[37]。果實(shí)的香氣物質(zhì)(芳香性揮發(fā)物質(zhì))是由果實(shí)組織中一些前體物質(zhì)(包括糖、氨基酸、脂肪等)在酶的作用下通過(guò)特殊的代謝合成途徑形成的[38-39]。不同的途徑酶的作用不同，但是生物的代謝途徑是錯(cuò)綜復(fù)雜的，某種酶既是這個(gè)途徑的限速酶，也可能是另一個(gè)代謝途徑的關(guān)鍵酶[40]。在果實(shí)(植物)組織中參與香氣合成的關(guān)鍵酶主要有脂氧合酶(LOX) 、醇脫氫酶(ADH) 和醇酰基轉(zhuǎn)移酶(AAT) 等，而β-葡萄糖苷酶近年來(lái)成為與香氣代謝相關(guān)的研究熱點(diǎn)，如范剛[20]、何芒芒[21]等對(duì)柑橘生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中β-葡萄糖苷酶的活性做了系統(tǒng)研究。

本文在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究了LOX，ADH，ATT和CB等與香梨果實(shí)最相關(guān)的4種酶類，其中前3種酶和果實(shí)的自由態(tài)香氣相關(guān)較為緊密，CB主要目的在于分析香梨生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中鍵合態(tài)香氣的代謝規(guī)律。從4種酶活性趨勢(shì)線來(lái)看，LOX，ADH和CB在香梨花后1個(gè)月左右至貨架期(2～3個(gè)月)總體是先高后低，傾斜向下，變化幅度較大；而ATT變化趨勢(shì)則與上述3種酶相反，酶活性變化出現(xiàn)先低后高的現(xiàn)象。另外，4種酶的活性變化最高點(diǎn)不一定是香梨最佳采摘期，這與前人對(duì)其他果實(shí)相同酶活性變化的研究結(jié)果不一致[20-21, 31, 41]，變化基本都在香梨最佳采摘期前，即果實(shí)的膨大期；酶活性變化趨勢(shì)與前人研究結(jié)果相似。

4 小結(jié)

果實(shí)的香氣代謝屬于次生代謝范疇，在各種代謝途徑之間酶的作用至關(guān)重要，也決定了果實(shí)的特征香氣[42]。酶對(duì)研究條件要求嚴(yán)格，是極易變性的催化蛋白質(zhì)，因此在實(shí)驗(yàn)操作中必須為其提供一個(gè)對(duì)于酶本身而言相對(duì)適合的環(huán)境，盡可能模擬果實(shí)的組織體系等。