補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑治療骨關(guān)節(jié)炎研究進(jìn)展

（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所，山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東 濟(jì)南 250062）

骨關(guān)節(jié)炎（OA）又稱退行性關(guān)節(jié)病[1]，其主要以關(guān)節(jié)邊緣軟骨異常增生、軟骨脫落為病理特征[2]，臨床表現(xiàn)為慢性關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)時(shí)伴有摩擦聲等，終末期可致患者關(guān)節(jié)畸形甚至喪失行走能力[3]。對于OA治療，傳統(tǒng)藥物大多僅能緩解癥狀，無法控制疾病進(jìn)展，效果不明顯，還會(huì)引發(fā)不良反應(yīng)。外科手術(shù)能快速延緩關(guān)節(jié)損傷，但不能很好地解決關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)與重建問題,更不能逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)一步被破壞的進(jìn)程[2,4]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜法研究表明[5]，補(bǔ)體蛋白在OA患者的關(guān)節(jié)滑液中發(fā)生異常表達(dá)，主要包括C3，C4，C5補(bǔ)體蛋白的異常增多，從而引起補(bǔ)體激活，C3和C5轉(zhuǎn)化酶形成增加，最終導(dǎo)致膜攻擊復(fù)合物（membrane attack complex，MAC）生成增多，促進(jìn)關(guān)節(jié)損傷和炎癥。本文對OA基于補(bǔ)體系統(tǒng)的分子發(fā)病機(jī)制進(jìn)行分析，并總結(jié)幾種針對C3，C4和C5的補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)劑，旨在為OA治療提供更多有效方案。

1 補(bǔ)體系統(tǒng)在OA發(fā)生發(fā)展中的免疫發(fā)病機(jī)制

研究表明，OA是先天免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的較低程度的炎癥[5]。分析OA患者滑液和細(xì)胞膜發(fā)現(xiàn)，先天性免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞和因子，包括補(bǔ)體激活片段和其促炎受體，均以明顯升高的水平存在于關(guān)節(jié)滑膜中，表明補(bǔ)體系統(tǒng)在OA組織損傷中有重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，OA患者關(guān)節(jié)滑液中的補(bǔ)體激活后，會(huì)產(chǎn)生多種補(bǔ)體成分，其中C3和C5轉(zhuǎn)化酶進(jìn)一步形成膜攻擊復(fù)合物，在靶細(xì)胞膜上形成膜孔通道，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，引發(fā)關(guān)節(jié)炎癥；同時(shí)，補(bǔ)體激活產(chǎn)物過敏毒素與補(bǔ)體激活誘導(dǎo)的趨化因子相互作用也引起骨損傷加重[6]。補(bǔ)體系統(tǒng)是先天免疫系統(tǒng)防御病原體的首要防線之一，是由30余種蛋白質(zhì)組成的不耐熱蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)攻擊性系統(tǒng)[7]，其成分復(fù)雜，包括直接參與補(bǔ)體激活的各種補(bǔ)體固有成分、調(diào)控補(bǔ)體激活的各種因子和分布于細(xì)胞膜上的補(bǔ)體受體等[8]。補(bǔ)體系統(tǒng)一般有宿主防御和通過過敏素和B、T淋巴細(xì)胞刺激來指導(dǎo)適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)的作用。因此在OA的分子機(jī)制中，還有另一條促使炎癥形成的路徑，即當(dāng)宿主細(xì)胞受到某種刺激時(shí)，攻擊系統(tǒng)啟動(dòng)，補(bǔ)體被激活，其中激活產(chǎn)生的C3和C5轉(zhuǎn)化酶可誘導(dǎo)產(chǎn)生C3a和C5a過敏素，兩種過敏素可誘導(dǎo)白細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，最終形成OA[9]。綜上所述，滑膜關(guān)節(jié)中補(bǔ)體系統(tǒng)的失調(diào)在OA的發(fā)病機(jī)制中起至關(guān)重要的作用。或可通過減少補(bǔ)體激活產(chǎn)物生成，防止細(xì)胞裂解，減輕關(guān)節(jié)炎癥。

2 基于補(bǔ)體系統(tǒng)的幾種補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑

補(bǔ)體系統(tǒng)激活引起的軟骨細(xì)胞裂解是目前較為認(rèn)可的OA發(fā)病機(jī)制，可由經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑任意一條途徑完成，再經(jīng)一系列絲氨酸蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)，形成MAC、趨化因子和促炎因子等介質(zhì)[10]?；谘a(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑能將抑制補(bǔ)體系統(tǒng)激活作為治療OA的首要目標(biāo)。同時(shí)，補(bǔ)體成分的多樣性和補(bǔ)體效應(yīng)蛋白又為OA的干預(yù)治療提供了多個(gè)潛在靶點(diǎn)。根據(jù)導(dǎo)致細(xì)胞裂解的MAC的主要組分，將補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)劑分為C3補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)劑、C4補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)劑、C5補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)劑和新型融合蛋白補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑。

2.1 C3補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)劑在OA治療中的作用

C3補(bǔ)體蛋白是補(bǔ)體系統(tǒng)中的主要成分，也是補(bǔ)體激活途徑中的重要中間體。補(bǔ)體激活的3種途徑均匯集于激活C3補(bǔ)體蛋白，生成C3轉(zhuǎn)化酶，與多種補(bǔ)體因子和非補(bǔ)體因子相互作用，引發(fā)各種生物學(xué)效應(yīng)。在OA的發(fā)生發(fā)展過程中，C3蛋白一方面形成C3轉(zhuǎn)化酶，進(jìn)一步誘導(dǎo)MAC形成；另一方面誘導(dǎo)生成C3a過敏素，引起免疫細(xì)胞分泌趨化因子，同時(shí)C3b還與CR3補(bǔ)體受體連接引發(fā)吞噬作用，共同促進(jìn)OA發(fā)生[11]。因此，抑制C3a和C3轉(zhuǎn)化酶形成，可有效治療骨關(guān)節(jié)炎癥。羧肽酶B（carboxypeptidase，CPB），是一種由Cpb2基因編碼，肝臟循環(huán)產(chǎn)生，凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物激活的纖維蛋白溶解抑制劑。有文獻(xiàn)報(bào)道[12]，CPB已被證明可裂解和滅活幾種炎癥蛋白，如C5a、C3a、緩激肽和凝血酶裂解的骨橋蛋白等。Christin等[13]研究表明，OA滑液中CPB的水平可能升高，并在緩解局部C5a介導(dǎo)的炎癥中起關(guān)鍵作用，且體外實(shí)驗(yàn)表明CPB很可能通過幾種不同的方式抑制MAC形成，從而保護(hù)關(guān)節(jié)免受炎癥破壞。靶向CPB治療是否在OA臨床試驗(yàn)中有保護(hù)作用尚待確定。另外，衰變加速因子CD55（decay accelerating factor，DAF，CD55）和膜輔因子蛋白（membrane cofactor protein，MCP，CD46）均有控制C3轉(zhuǎn)化酶的功能。

有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，sushi域結(jié)合蛋白4（sushi domain-containing protein 4，SUSD4）也能通過抑制經(jīng)典途徑中C3轉(zhuǎn)化酶形成，抑制補(bǔ)體激活。由于基因剪接選擇性的存在，含SUSD4結(jié)構(gòu)域的蛋白一般為膜結(jié)合蛋白或可溶性蛋白，如可溶性因子H或膜結(jié)合的CD46，通常與活化的組分C3b和C4b結(jié)合，并誘導(dǎo)絲氨酸蛋白酶因子Ⅰ降解，從而阻礙C3轉(zhuǎn)化酶形成[15]。但SUSD4只在食道、腦和心臟等組織中有較高的表達(dá)，還沒有相關(guān)文獻(xiàn)表明其可在軟骨組織表達(dá)[16]。Nikolina等[17]研究表明，膠原蛋白Ⅸ的N末端非膠原結(jié)構(gòu)域4（N-terminal noncollagenous domain 4，NC4）可作為補(bǔ)體系統(tǒng)的新型抑制劑發(fā)揮作用，能與C4、C3和C9補(bǔ)體成分結(jié)合，并直接抑制C9聚合從而抑制MAC組裝，促進(jìn)補(bǔ)體成分C4b和C3b的酶促裂解，加速對C3的裂解，抑制補(bǔ)體激活。血漿H因子（factor H，fH）是替代途徑的主要調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)因子I介導(dǎo)的C3b蛋白水解為iC3b 1，加速C3轉(zhuǎn)化酶的衰變[18]。fH的補(bǔ)體調(diào)節(jié)功能大多歸功于其與FHR家族（FHR-1，F(xiàn)HR-2，F(xiàn)HR-3，F(xiàn)HR-4，F(xiàn)HR-5）的相互作用，其中FHR-1起主要作用，通過阻止C5經(jīng)由C5轉(zhuǎn)化酶裂解，從而抑制C5a釋放，減少C5b-9形成，達(dá)到調(diào)節(jié)補(bǔ)體末端途徑激活，減少細(xì)胞裂解的目的[19-20]。

2.2 C5補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)劑在OA治療中的作用

C5是補(bǔ)體系統(tǒng)中的重要組分，直接參與補(bǔ)體活化過程，其活化產(chǎn)物C5a過敏毒素可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌炎癥因子，通過C5a受體C5aR1介導(dǎo)促炎作用，從而促進(jìn)宿主防御，且能調(diào)節(jié)組織體內(nèi)平衡。過敏毒素C5a是先天免疫的有效介體[21]，在外源性和內(nèi)源性病原體及損傷相關(guān)分子模式激活補(bǔ)體系統(tǒng)后，通過其受體C5aR1促進(jìn)炎癥。在成骨細(xì)胞中，C5a誘導(dǎo)了炎癥細(xì)胞因子白介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-8的遷移和表達(dá)，對骨質(zhì)形成和活性至關(guān)重要[22]。敲除了C5aR1基因的小鼠關(guān)節(jié)中破骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨量顯著增加，表明C5a/C5aR1信號(hào)可能調(diào)節(jié)骨骼的生理轉(zhuǎn)換[23]。病理?xiàng)l件下，缺乏C5aR1的小鼠可抵抗關(guān)節(jié)炎侵害，且C5aR1的活性與骨骼中大量骨丟失有關(guān)，C5aR1拮抗劑可顯著減少該模型中的牙周炎癥和隨后的骨質(zhì)流失[24]。隨后發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞是C5a的靶細(xì)胞[25]，因?yàn)槌晒羌?xì)胞特異性C5aR1過表達(dá)的小鼠顯示出骨折愈合受損[26]。Yvonne等[27]分析了C5aR1激活后的基因表達(dá)模式和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)現(xiàn)還涉及MAPK和胰島素途徑基因的強(qiáng)調(diào)控。此外，還證明了C5aR1和Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）在成骨細(xì)胞中相互作用，導(dǎo)致免疫細(xì)胞趨化因子上調(diào)，這可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞重新吸收[28]。這些結(jié)果表明，補(bǔ)體激活的成骨細(xì)胞能與破骨細(xì)胞和免疫細(xì)胞協(xié)同調(diào)節(jié)炎癥性骨疾病期間的炎癥環(huán)境。

Wang等[15]研究證明了單克隆抗體（anti-C5 monoclonal antibody，mAb）能抑制C5處的末端補(bǔ)體激活，使C5a與C5aR1結(jié)合減少，減弱促炎作用，減少骨損傷，表明抗C5的單克隆抗體能有效防止并延緩膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎發(fā)生。CD59是一種有效阻止MAC形成的膜蛋白，該膜蛋白可通過抑制其他C9分子插入C5b-9復(fù)合物的方式，抑制大型MAC形成，維持軟骨細(xì)胞的完整性[29]。Bloom等[30]研究雄性小鼠CD59a基因缺失對維持骨骼結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明CD59a基因缺失可導(dǎo)致骨骼體積變大，密度變小，使小鼠更易患OA。另外，內(nèi)源性補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白還包括衰變加速因子CD55，主要通過抑制體內(nèi)C3、C5轉(zhuǎn)化酶形成阻止補(bǔ)體活化。目前，針對C5補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)劑藥效動(dòng)力學(xué)研究，提出了新型特異性抗體重組抗C5微型抗體MB12/22[31]，其能特異性識(shí)別人補(bǔ)體C5，參與補(bǔ)體激活抑制過程，關(guān)節(jié)內(nèi)注射的MB12/22能減少關(guān)節(jié)滑膜的損傷，緩解關(guān)節(jié)腫脹，降低腫瘤壞死因子水平，改善組織形態(tài)學(xué)變化。

2.3 C4補(bǔ)體蛋白調(diào)節(jié)劑在治療OA中的作用

C4補(bǔ)體蛋白是滑液中同源型補(bǔ)體因子C4a和C4b的混合物[32]，也是經(jīng)典途徑和凝集素途徑中的共同成分，能裂解補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑中的C3補(bǔ)體。C4b結(jié)合蛋白（C4-binding protein，C4BP）是經(jīng)典和凝集素途徑的主要可溶性內(nèi)源抑制劑，是一種血漿寡聚糖蛋白，其主要功能包括調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活和止血。有文獻(xiàn)報(bào)道[33]，C4BP不僅與凝血有關(guān)，在成纖維細(xì)胞的結(jié)締組織重塑過程中也可能起作用。纖維蛋白在滑膜組織內(nèi)沉積是滑膜炎的一個(gè)突出特征，纖維蛋白-成纖維細(xì)胞相互作用可能是滑膜細(xì)胞活化導(dǎo)致獲得OA侵襲性表型的決定因素。每個(gè)C4BP鏈均有一個(gè)C4b2結(jié)合位點(diǎn)，C4BP主要通過與膜結(jié)合性維生素K依賴性蛋白S相互作用[34-35]，從而減少C3轉(zhuǎn)化酶形成，抑制補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑。通過這種機(jī)制，可防止?jié)撛谟泻Φ难a(bǔ)體過度活化。

對于OA，調(diào)控補(bǔ)體系統(tǒng)失調(diào)的控制因子還有很多，怎樣將自身免疫系統(tǒng)的補(bǔ)體抑制劑作用放大并用于臨床將是目前防治的關(guān)鍵。為了防止補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷，系統(tǒng)的活化和抑制之間需要通過幾種可溶性膜結(jié)合的抑制劑建立良好的平衡。大多數(shù)抑制劑通過以下兩種途徑起作用：加速補(bǔ)體轉(zhuǎn)化酶的衰變，或通過絲氨酸蛋白酶Ⅰ因子促進(jìn)活化的補(bǔ)體因子C3b和C4b的酶促裂解。1型補(bǔ)體受體（complement receptor1，CR1）或稱CD35是紅細(xì)胞、白細(xì)胞等膜上的糖蛋白，有加速補(bǔ)體因子衰變的活性，并作為輔酶促進(jìn)C3b、C4b對C3的裂解作用，是一種有效的補(bǔ)體激活抑制劑[36]。能輔助C3b、C4b裂解作用的因子還有很多，如fH為一種主要的補(bǔ)體可溶性抑制劑，通常與活化的組分C3b和C4b結(jié)合，并誘導(dǎo)絲氨酸蛋白酶Ⅰ因子降解[37]，還可阻止替代途徑中補(bǔ)體C3轉(zhuǎn)化酶組裝并加速其降解[38]。另外，Sj?berg等[39]進(jìn)一步驗(yàn)證了fH與纖維調(diào)節(jié)蛋白（fibromodulin，F(xiàn)MOD）和骨黏附素（osteoadherin，OSAD）結(jié)合，能增強(qiáng)彼此的補(bǔ)體抑制活性。該研究在闡明補(bǔ)體和細(xì)胞外基質(zhì)成分之間相互作用方面取得了一些進(jìn)展，可指導(dǎo)開發(fā)對抗異常補(bǔ)體激活的新型療法。

2.4 融合蛋白作為補(bǔ)體調(diào)節(jié)劑在治療OA中的作用

新型融合蛋白能特異性靶向作用于某種補(bǔ)體蛋白，將大大提高其對補(bǔ)體系統(tǒng)的抑制效果。為進(jìn)一步評估補(bǔ)體系統(tǒng)在OA動(dòng)物模型中的作用，Banda等[40]研究了含有補(bǔ)體受體2（complement receptor 2，CR2）和fH的重組替代途徑抑制劑CR2-fH（complement receptor 2 and factor H，CR2-fH）對膠原誘導(dǎo)型OA模型小鼠的治療作用[41]。該試劑包含編碼來自CR2的iC3b/C3d結(jié)合位點(diǎn)的氨基末端結(jié)構(gòu)域和替代途徑誘導(dǎo)的OA小鼠fH的5個(gè)短重復(fù)序列的氨基末端[42]。在對含Ⅱ型膠原蛋白和Ⅱ型膠原單克隆抗體的免疫復(fù)合物進(jìn)行的體外研究中，小鼠滑膜和軟骨中的C3沉積顯著降低，C3a生成減少，MAC生成顯著減少，關(guān)節(jié)損傷減輕。表明CR2-fH有體外特異性靶向C3補(bǔ)體作用，并特異性抑制補(bǔ)體激活的替代途徑，對經(jīng)典途徑的影響最小，對凝集途徑幾乎無影響[42]。Michelfelder等[43]研究了一種新穎的組合方法，合成新的融合蛋白MFHR1。該蛋白將fH的調(diào)節(jié)域與FHR-1的C5轉(zhuǎn)化酶/C5b-9抑制片段連接起來。在功能上，該蛋白將fH的C3調(diào)控域和其能靶向細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)域，與衍生自FHR-1的C5b-9形成抑制末端途徑調(diào)控域結(jié)合起來，通過同時(shí)靶向C3和末端途徑來調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活。OA體外試驗(yàn)中，MFHR1在抑制C5轉(zhuǎn)化酶激活和C5b-9組裝方面表現(xiàn)出輔助因子和衰變加速功能，阻止C3b沉積并減少C3a、C5a和C5b-9的生成[44]。結(jié)果表明，MFHR1能在多個(gè)級聯(lián)水平上同時(shí)靶向補(bǔ)體激活，可提供優(yōu)化的補(bǔ)體抑制作用，主要抑制經(jīng)典途徑和替代途徑的活性。因此，MFHR1可能為補(bǔ)體相關(guān)疾病的治療提供新的基礎(chǔ)。與單獨(dú)靶向C3或C5的方法相比，調(diào)節(jié)劑在補(bǔ)體級聯(lián)中同時(shí)影響多個(gè)效應(yīng)位點(diǎn)[45]，包括抑制C3抑制、C5裂解抑制和C5b-9形成。特別是由于MFHR1還可阻止C3a和C5a形成及C3裂解產(chǎn)物積聚，有望對其他補(bǔ)體相關(guān)疾病中的局部炎癥和疾病進(jìn)展產(chǎn)生積極影響。除了MFHR1調(diào)節(jié)補(bǔ)體過度活化的治療潛力外，這種多靶點(diǎn)策略可指導(dǎo)開發(fā)更多新的補(bǔ)體療法。

3 總結(jié)與展望

隨著人們對OA病理機(jī)制的深入了解，補(bǔ)體系統(tǒng)成分的多樣性和復(fù)雜性為補(bǔ)體多靶點(diǎn)治療提供依據(jù)，為盡快尋找有效的OA治療藥物，新型融合蛋白補(bǔ)體抑制劑的開發(fā)可作為未來治療OA的研究重點(diǎn)。相信隨著各種新方法和生物學(xué)新技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用，OA的治療效果會(huì)越來越好。