P-PRP凝膠制備方案研究進展

劉 悅 張雪松

(佳木斯大學(xué) 整形外科，黑龍江 佳木斯 154000)

P-PRP由抗凝全血通過離心或過濾獲得，含低濃度白細胞和高濃度血小板，P-PRP凝膠是加入激活劑形成的膠凍狀物，激活后，血小板通過脫顆粒作用釋放多種生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β1和β2等[1]。本文就P-PRP的制備方案研究進展做一綜述。

1 P-PRP的制備過程考查因素

1.1 制備人員的選擇

2019年Naoya Kikuchi等學(xué)者將2名具有制備經(jīng)驗的骨科醫(yī)生作為E組，將只看了3次由BTI生物科技研究所制作的具有教育意義DVD的人設(shè)為NE組，比較兩組制備的PRP有無質(zhì)的差別，結(jié)果表明制備PRP的經(jīng)驗對PRP的質(zhì)量沒有影響，但作者認為還是應(yīng)盡量選擇有經(jīng)驗的人制備[2]。

1.2 抗凝劑的選擇

枸櫞酸鹽抗凝是通過與Ca2+形成難解離的可溶性絡(luò)合物枸櫞酸鈣(ACD-A)。ACD-A更接近生理性凝血，有利于保護血小板內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，從而提高血小板的整體反應(yīng)性，所以ACD-A應(yīng)用更為廣泛[3, 4]?？鼓? mL 血液至少需要6 mg的枸櫞酸鹽，值得注意的是超過300 mL可能引起低鈣血癥等中毒反應(yīng)[5]。

1.3 離心力和離心時間的選擇

不同的離心參數(shù)對制備出的P-PRP有較為明顯的影響[6-9]。P-PRP制備方法包括血液過濾法和密度梯度離心法。Mccarrel TM等學(xué)者[10]采用The Purecell Select System for Whole Blood MNC Enrichment,根據(jù)制造商說明過濾血液，可得到白細胞減少血，再經(jīng)Smart Prep 2 system離心，并根據(jù)生產(chǎn)商說明重懸，得到白細胞減少PRP。由于其操作復(fù)雜，需要特殊設(shè)備及耗材，成本較高，所以密度梯度離心法應(yīng)用更為廣泛。密度梯度離心法基于斯托克斯定律。1851年，英國數(shù)學(xué)家、物理學(xué)家斯托克斯發(fā)現(xiàn)并提出這一定律，即液體都具有一定程度的粘滯性，體積較小的球形物體在層流速度較小的流體中運動時，粘滯阻力能夠運用此定律來描述。該定律提示，血細胞在血漿中的沉降率隨離心力的增加而增加[11]，離心力可以加速血小板、白細胞，紅細胞在血漿中沉降，并且增加沉降速率的差別，最終在試管內(nèi)分為血漿層，白細胞層，紅細胞層。為最大限度回收血小板，還要選取恰當(dāng)?shù)碾x心時間，因其能夠確保沉降速率的差別。制備L-PRP與P-PRP的差別在于轉(zhuǎn)移白細胞層，應(yīng)用移液管轉(zhuǎn)移更為準確有效。密度梯度離心法包括一次和兩次離心法，Sanchez M等學(xué)者[12]使用抗凝全血以580×g，8 min獲得P-PRP,其所含白細胞稀少，血小板濃度是全血的2～3倍，大量實驗證明二次離心法提取率、血小板濃度更高，臨床應(yīng)用也更為廣泛。第一次選取較小的離心力能降低紅細胞間隙中血小板沉積，第二次選取略大的離心力有助于回收血小板且防止其早期被激活[13]。兩次離心法有兩個影響血小板回收率的主要因素，一是多數(shù)血小板保留在血漿層內(nèi)，沒有進入白細胞層被遺棄，且所有白細胞均沉降至白細胞層內(nèi)，避免為了除去白細胞而損耗血小板；二是確保經(jīng)第二次離心獲取的P-PRP保留血漿層中的大多數(shù)血小板，而沒有因為在上層血漿中懸浮而隨之丟棄[14]。Bausset O等學(xué)者使用抗凝全血經(jīng)Thermo Scientific 以130×g，15 min進行軟旋轉(zhuǎn)，隨后進行硬旋轉(zhuǎn)，時間為15 min，以不同離心速度進一步濃縮血小板，離心速度分別為130×g、250×g、400×g、1 000×g，結(jié)果顯示250×g離心時血小板數(shù)量大于其他速度，說明高轉(zhuǎn)速可能對血小板功能有害，130×g離心時活化狀態(tài)的血小板更少，說明較低的離心速度更有利于血小板靜息狀態(tài)的保存，P-PRP中P-selection增加，意味著血小板對激動劑的反應(yīng)性降低，與400×g相比，血小板濃度較低時，250×g離心速度血小板對激動劑的反應(yīng)性略有改善，且形態(tài)變化較小[15]，因此250×g，15 min或許是富集40 mL抗凝全血中血小板的最佳第二次離心。但Magalon等學(xué)者發(fā)覺，Bausset法盡管在較多指標(biāo)方面強于現(xiàn)有的P-PRP制備方案，卻不能優(yōu)化血小板回收率[16]。殷文靖學(xué)者認為產(chǎn)生這一結(jié)果的原因是Bausset等學(xué)者在沒有進行試驗研究的情況下果斷的選擇130×g，15 min作為第一次離心方案。前期實驗證明，110×g，15 min或許導(dǎo)致部分白細胞遺留血漿層中，180×g，10 min或許導(dǎo)致白細胞層進入多數(shù)血小板，另外，180×g，10 min與450×g，15 min之間的第二次離心都能使P-PRP中包含血漿層中的多數(shù)血小板。據(jù)此殷文靖等通過對照實驗選取110×g，15 min至180×g，10 min之間對PCP各細胞含量最有利及180×g，10 min至450×g，15 min之間對血小板功能最有利的兩次離心法最佳方案，實驗結(jié)果表明，各P-PRP樣本中白細胞濃度、紅細胞濃度、白細胞清除率、紅細胞清除率、炎癥因子濃度、基礎(chǔ)血小板CD62P表達率接近，160×g，10 min能夠保證血小板功能并且除去白細胞和紅細胞以及盡可能回收血小板[14]，250×g，15 min 相對于較弱方案ADP誘導(dǎo)的CD62P表達率顯著升高，意味著可以保證血小板對激動劑的反應(yīng)性，與更強的離心方案相比血小板回收率和富集度無顯著差異，第二次離心是為了盡可能富集血小板并保護血小板功能，綜上所述，160×g，10 min續(xù)以250×g，15 min或許是使用40 mL抗凝全血制備P-PRP的最佳方案。

1.4 激活劑的選擇

將P-PRP運用在臨床或科研研究時常應(yīng)用外源性激活劑將其激活，推動生長因子自血小板α顆粒釋放[17]。P-PRP樣本加入激活劑得到的凝膠內(nèi)生長因子濃度可達到全血3～7倍[18]，凝血酶激活劑使血小板10 min內(nèi)釋放70%生長因子，且能使幾乎全部生長因子1小時內(nèi)釋放[19]，但常用的凝血酶激活劑通常為牛來源，牛凝血酶在使用中存在不確定性，因為其在使用過程中通常會形成人凝血蛋白抗體[20, 21]，可能引發(fā)致命性凝血紊亂，但Mrax認為凝膠中的牛凝血酶劑量少，固化在P-PRP凝膠內(nèi)，且未進入循環(huán)系統(tǒng)，不會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂[22]。凍融循環(huán)激活與Cacl2激活的PRP作比較，Cacl2激活可加速凝膠化支架中的纖維蛋白原，得到的P-PRP凝膠中PDGF-BB水平顯著升高[2]，而且與牛凝血酶相比其可以避免免疫反應(yīng)和疾病傳播風(fēng)險[23]，與生理凝血過程更相似，并使生長因子釋放更持久[24]，因此Cacl2更適合作為激活劑使用，但其使用小口徑針頭時注射困難[25]，因此，在臨床中需要根據(jù)應(yīng)用部位和治療目的來選擇激活方法。

2 展望

P-PRP凝膠的制備方案隨著組織工程技術(shù)的進一步發(fā)展出現(xiàn)多元化及成熟化的趨勢，不同制備方案擁有不同的優(yōu)點，依據(jù)某一項數(shù)據(jù)獨斷哪種制備方案最好是錯誤的，雖然當(dāng)下P-PRP凝膠在臨床應(yīng)用中的效果存在爭論，但無可厚非的是，其在組織修復(fù)研究中有廣闊的應(yīng)用前景。