全自動(dòng)SPE-LC-MS/MS 法測(cè)定雞蛋中的多種獸藥殘留

常晨陽，韓煥美，潘迎芬，單嬌，朱秀煥，劉偉

(1.聊城海關(guān) 山東聊城 252200；2.濟(jì)南 海關(guān)濟(jì)南 252000；3.東山海關(guān) 福建漳州 363401；4.黃島海關(guān) 山東青島 266500)

由于養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)過程中獸藥使用不規(guī)范或不科學(xué)等問題，雞蛋中獸藥殘超標(biāo)事件經(jīng)常被報(bào)出[1]，目前國標(biāo)對(duì)雞蛋中獸藥殘留的檢測(cè)方法是對(duì)不同種類獸藥分別檢測(cè)[2]，操作復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力。本研究以雞蛋日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中高風(fēng)險(xiǎn)的喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、抗病毒類、聚醚類抗生素、硝基咪唑類、抗球蟲藥類、大環(huán)內(nèi)酯類8 大類共31 種獸藥為檢測(cè)對(duì)象，優(yōu)化雞蛋中獸藥殘留的提取凈化方法，應(yīng)用全自動(dòng)固相萃取SPE 代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工固相萃取操作，使得操作簡單省時(shí)[3]。聯(lián)用可實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高通量檢測(cè)的高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀LC-MS/MS[4]，建立了雞蛋中多種獸藥殘留的同時(shí)檢測(cè)方法，為雞蛋樣品的藥殘風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供新的技術(shù)手段，同時(shí)為蛋雞養(yǎng)殖業(yè)科學(xué)用藥提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備

首先分別準(zhǔn)確稱量約10mg 固體標(biāo)準(zhǔn)品，于100mL 容量瓶中用乙腈定容，配制100μg/mL 濃度的單標(biāo)儲(chǔ)備液，然后根據(jù)待測(cè)的線性范圍配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)中間液，吸取一定量體積，用陰性雞蛋樣品基質(zhì)提取液制備混合標(biāo)準(zhǔn)濃度系列。

配制喹諾酮類（氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星、氟甲喹）的線性范圍為5～100μg/kg、磺胺類（磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺多辛）為10～200μg/kg、四環(huán)素類（土霉素、四環(huán)素、金霉素）10～200μg/kg、抗病毒類（金剛烷胺）1～100μg/kg、聚醚類抗生素（鹽霉素）10～200μg/kg、硝基咪唑類（洛硝噠唑、甲硝唑、異丙硝唑、二甲硝咪唑、羥基甲硝唑）0.5～100μg/kg、抗球蟲藥類（氯羥吡啶）5～100μg/kg、大環(huán)內(nèi)酯類（替米考星、竹桃霉素、紅霉素、交沙霉素）1～100μg/kg。

1.2 提取溶液的配制

提取溶劑為0.1mol/L 的Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖液，配制方法為：稱取37.2g 乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-2Na）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）10.9g、檸檬酸（C6H8O7·H2O）12.9g，用水溶解后稀釋于1,000mL 容量瓶中定容，之后用1mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 至4.0。

1.3 樣品前處理

1.3.1 預(yù)處理取新鮮雞蛋樣品，去殼取可食部分在高速勻漿機(jī)中充分?jǐn)嚢杈鶆?，置于干凈容器中密封保存?℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 提取準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的雞蛋樣品1.0g（精確到0.01g）于50mL 離心管中，加入10mL 1.2 的提取溶液，渦旋混勻后，超聲提取5min，10,000r/min 離心2min 后，轉(zhuǎn)移出上清液至新的離心管中，再吸取10mL 提取溶液按上述操作重復(fù)提取一次。合并兩次提取上清液，加入5mL 正己烷，渦旋1min 后，10,000r/min 離心2min，取下層清液經(jīng)固相萃取凈化。

1.3.3 凈化在全自動(dòng)固相萃取儀工作站上設(shè)置洗脫程序，使用親水親脂共平衡聚合物基體反相InertSep HLB（200mg/6mL）固相萃取小柱凈化待測(cè)目標(biāo)物。程序設(shè)定見表1。

表1 全自動(dòng)固相萃取儀設(shè)定洗脫程序

1.3.4 濃縮上機(jī)將1.3.3 中收集的洗脫液于38℃下氮吹至近干，用10%甲醇水（含0.1%甲酸）溶液定容至1mL，渦旋混勻后，過0.22μm PTFE 濾膜，經(jīng)高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack GISS C18（100×2.1mm，2μm）；流速：0.4mL/min；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：40℃；流動(dòng)相：A 0.1%甲酸水，B 甲醇；梯度洗脫程序：0～1min,10%B；1～3min，10%B→50%B；3～6min，50%B→70%B；6～8min，70%B→90%B；8～11min，90%B；11～11.5min，90%B→10%B；11.5～13min，10%B。

1.5 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源ESI，正離子模式；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；接口溫度：300℃；DL 溫度：260℃；加熱模塊溫度：400℃；碰撞氣：高純氬氣（≥99.999%）；加熱氣：氮?dú)?0L/min；霧化氣：高純氮?dú)?.0L/min；干燥氣：氮?dú)?0L/min。各化合物的母離子、子離子、碰撞電壓參見國標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶液的選擇

提取溶液要考慮雞蛋基質(zhì)本身富含蛋白質(zhì)和脂肪的特點(diǎn)，同時(shí)兼顧待測(cè)31 種性質(zhì)存在差異的獸藥分子的回收效率。Mcllvaine-Na2EDTA 緩沖液中的檸檬酸鹽溶液在提取多種有機(jī)物分子的同時(shí)能夠很好的沉淀蛋白；其中的EDTA-Na2可以絡(luò)合溶液中金屬離子，顯著提高四環(huán)素類藥物的回收率；正己烷的脫脂操作，可進(jìn)一步降低雞蛋中脂類干擾。

2.2 全自動(dòng)固相萃取儀的優(yōu)勢(shì)

固相萃取是農(nóng)獸殘?zhí)崛≈凶畛Ｓ玫降膬艋绞絒5]，可顯著降低基質(zhì)效應(yīng)。但是操作步驟多、比較耗時(shí)。全自動(dòng)固相萃取是近年來興起的一種自動(dòng)化前處理設(shè)備，且全封閉式操作減少污染的風(fēng)險(xiǎn)，使的操作更簡便、可靠。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比全手動(dòng)過柱操作、帶空氣泵的半自動(dòng)過柱和全自動(dòng)固相萃取三種操作方式，統(tǒng)計(jì)人工操耗時(shí)、回收效率（以氧氟沙星數(shù)據(jù)為例），數(shù)據(jù)見表2，可見全自動(dòng)固相萃取可減少手動(dòng)工作，尤其在處理多個(gè)樣品時(shí)，可明顯提高工作效率，且因人為誤差減少，RSD 值更小，回收率穩(wěn)定重復(fù)性更好。

表2 手動(dòng)、半自動(dòng)、全自動(dòng)固相萃取過柱方式比較

2.3 實(shí)驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證

通過參考GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》，配制31 種獸藥的線性范圍，線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。1.1 中所配標(biāo)準(zhǔn)曲線的第一個(gè)點(diǎn)的信噪比（S/N）均大于10，符合最低定量限要求。通過陰性雞蛋樣品進(jìn)行5μg/kg 和50.0μg/kg 兩個(gè)濃度水平加標(biāo)，按照1.2.1 經(jīng)前處理上機(jī)檢測(cè)，每組平行6 份樣品，考察回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。具體結(jié)果如下：5μg/kg 加標(biāo)濃度的加標(biāo)回收率69.5%～110.2%，RSD 為0.95%～10.4%；50μg/kg 加標(biāo)濃度的加標(biāo)回收率為72.4%～106.1%，RSD 為0.45%～11.8%，符合國標(biāo)GB/T 27417—2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》中對(duì)回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求，滿足定性和定量檢測(cè)要求。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

從超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、養(yǎng)殖戶等不同渠道購買抽樣，累計(jì)對(duì)60 批次雞蛋中31 種獸藥進(jìn)行高通量測(cè)定，二批次檢出陽性結(jié)果。一批次檢出氧氟沙星6.34μg/kg，一批次檢出磺胺間甲氧嘧啶20.1μg/kg，金剛烷胺17.6μg/kg。用國標(biāo)方法GB/T 20366—2006、GB/T 21316—2007、GB31660.5—2019 對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)檢，陽性檢出項(xiàng)目一致，數(shù)據(jù)見表3，檢出量偏差小于5%，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性。

表3 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果與國標(biāo)方法對(duì)比（μg/kg）

3 結(jié)論與展望

在雞蛋中檢出的獸藥殘留有違規(guī)使用獸藥、不遵守休藥期規(guī)定等多方面原因。高通量檢測(cè)相對(duì)于單項(xiàng)目檢測(cè)，可大幅提高檢測(cè)速度，節(jié)約檢測(cè)資源和成本，是實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)需求的重要方式。

本方法結(jié)合雞蛋樣品的特點(diǎn)，將可實(shí)現(xiàn)凈化過程自動(dòng)化操作的全自動(dòng)固相萃取儀和高檢測(cè)靈敏度的液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀聯(lián)合應(yīng)用，成功實(shí)現(xiàn)雞蛋中喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類、抗病毒類、聚醚類抗生素、硝基咪唑類、抗球蟲藥類、大環(huán)內(nèi)酯類、8 大類共31 種獸藥殘留的高通量同時(shí)檢測(cè)，該方法操作簡單、前處理自動(dòng)化程度高，定量準(zhǔn)確，重復(fù)性好，既可滿足日常檢測(cè)需要，又為雞蛋藥殘風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控、蛋雞養(yǎng)殖期安全用藥提供有力的技術(shù)支撐。