光譜重構(gòu)油菜葉綠素含量快速檢測(cè)方法及設(shè)備研制

翁海勇，黃俊昆，萬(wàn) 亮，葉大鵬*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，福建 福州 350002 2. 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058

引 言

葉綠素是植物最重要的色素之一，是判斷植物健康狀態(tài)的重要指標(biāo)[1]。當(dāng)植物遭受生物和非生物脅迫時(shí)，葉片中的葉綠素含量會(huì)隨之改變。因此，葉片中葉綠素含量的快速檢測(cè)對(duì)植物健康狀態(tài)的診斷具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。傳統(tǒng)上，葉綠素含量的測(cè)量主要采用紫外分光光度法，雖然結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是操作繁瑣，屬于離線測(cè)量，結(jié)果滯后，并且產(chǎn)生一系列化學(xué)廢棄液，污染環(huán)境，無(wú)法滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對(duì)植物健康狀態(tài)精準(zhǔn)高效監(jiān)測(cè)的需求。

光學(xué)技術(shù)因其無(wú)損、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)在作物生理狀態(tài)監(jiān)測(cè)中具有重要的應(yīng)用前景。有學(xué)者根據(jù)葉綠素對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收率不同的原理開(kāi)發(fā)了手持式相對(duì)葉綠素測(cè)量?jī)x[2]和絕對(duì)葉綠素檢測(cè)儀[3-5]。上述設(shè)備成本低廉，操作方便，但是屬于單點(diǎn)測(cè)量，不同測(cè)量點(diǎn)之間數(shù)據(jù)波動(dòng)性較大，也無(wú)法反映葉綠素在整個(gè)葉片分布的情況，并且檢測(cè)的結(jié)果也會(huì)受到葉片厚度和類型變化的影響。張建等[6]利用普通單反相機(jī)搭載濾波片的方式拍攝了水稻葉片的可見(jiàn)光和近紅外圖像，實(shí)現(xiàn)了葉片SPAD的測(cè)量。雖然SPAD值與葉綠素濃度存在較好的相關(guān)性，但對(duì)于不同類型的植物葉片，其SPAD值與葉綠素濃度之間的關(guān)系模型卻不盡相同[7]。由于光譜成像技術(shù)同時(shí)獲取了光譜信息和圖像信息，能夠?qū)崿F(xiàn)植物生理狀態(tài)和養(yǎng)分分布的可視化表達(dá)。石吉勇等[8]應(yīng)用高光譜成像提取了整個(gè)葉片的平均光譜并建立遺傳偏最小二乘葉綠素校正模型，實(shí)現(xiàn)了葉綠素在黃瓜葉片表面的分布，為黃瓜的長(zhǎng)勢(shì)狀態(tài)提供了有效的參考信息。甘海明等[9]結(jié)合高光譜成像技術(shù)和深度學(xué)習(xí)實(shí)現(xiàn)了龍眼葉片葉綠素含量的預(yù)測(cè)，為龍眼的生長(zhǎng)狀況及養(yǎng)分分布提供理論依據(jù)。Feng等[10]利用高光譜成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)不同生長(zhǎng)期水稻葉片葉綠素含量的快速檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了水稻生長(zhǎng)狀況的快速診斷。Shi等[11]獲取了黃瓜葉片的近紅外高光譜圖像，結(jié)合多元線性回歸模型實(shí)現(xiàn)了葉綠素含量的快速檢測(cè)。與非成像的手持式葉綠素檢測(cè)儀相比，上述成像設(shè)備雖然能夠準(zhǔn)確地獲取到葉綠素濃度及其在葉片空間的分布情況，但是儀器設(shè)備成本高，體積大，無(wú)法被大面積推廣使用。

鑒于上述情況，有必要開(kāi)發(fā)一款體積小、成本低廉、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠且能夠使葉綠素含量在整個(gè)葉片可視化表達(dá)的手持式設(shè)備。因此，以油菜為研究對(duì)象，采用自主研發(fā)的手持式多光譜成像系統(tǒng)采集油菜葉片的多光譜圖像，融合光譜重構(gòu)技術(shù)，提高光譜分辨率，以期提高模型對(duì)葉綠素含量的反演能力，從而為油菜的生理狀態(tài)以及養(yǎng)分的精準(zhǔn)化管理提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 油菜葉片采集

油菜來(lái)源于浙江省杭州市西湖區(qū)浙江大學(xué)紫荊港校區(qū)西區(qū)試驗(yàn)田。油菜品種為浙大630，物候期為苗期。試驗(yàn)田分成三個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)地塊面積為6.4 m×24.4 m，三塊小區(qū)的氮肥(尿素)施肥量分別為75, 150和225 kg·ha-1，磷肥(過(guò)磷酸鈣)和鉀肥(氯化鉀)的施用量均分別為60和150 kg·ha-1。尿素在12月中旬和來(lái)年2月份中旬施肥，磷酸鈣和氯化鉀則在油菜種植前施一次。為了使試驗(yàn)數(shù)據(jù)分布范圍盡可能大，在采樣過(guò)程中分別從每個(gè)小區(qū)內(nèi)采集100片(共300片)不同葉綠素含量的油菜葉片作為研究對(duì)象。

1.2 多光譜和高光譜圖像采集

為了實(shí)現(xiàn)油菜葉片葉綠素的快速無(wú)損精準(zhǔn)檢測(cè)，本文開(kāi)發(fā)了便攜式多光譜成像系統(tǒng)，用于油菜葉片多光譜圖像的采集。該設(shè)備主要包含了分辨率為480×640 pixels的單色黑白CMOS相機(jī)(MT9V032, ON Semiconductor, Phoenix, Arizona, USA)，光源LED(Epileds Technologies, Inc, Taiwan, China)、鏡頭(M0814-MP, CBC Corporation, Tokyo, Japan)和上位機(jī)軟件[圖1(a)]。在繪制電路板時(shí)，每個(gè)波長(zhǎng)的LED安裝3個(gè)，間隔為120°[圖1(b)]。六個(gè)波段LED的中心波長(zhǎng)分別為460，520，660，740，840和940 nm，半帶寬均為25 nm[圖1(c)]。上位機(jī)軟件依次觸發(fā)不同波長(zhǎng)LED的驅(qū)動(dòng)電路，從而依次點(diǎn)亮對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的LED，此時(shí)相機(jī)采集對(duì)應(yīng)波段的光譜圖像，構(gòu)成多光譜圖像立方塊[圖1(d)]。為了實(shí)現(xiàn)光譜重構(gòu)，提高光譜分辨率，本試驗(yàn)選取了室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)作為參考儀器[圖1(e)]。高光譜成像系統(tǒng)主要由分辨率為672×512 pixels的CCD相機(jī)(C8484-05, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan)、線光源(Fiber-Lite DC950, Dolan Jenner Industries Inc., Boxborough, MA)、波長(zhǎng)范圍為379～1 023 nm、分辨率為2.8 nm的光譜儀(ImSpector V10E, Spectral Imaging Ltd., Oulu, Finland)、電控移動(dòng)平臺(tái)、暗箱和電腦。為了使樣品的多光譜和高光譜圖像一一對(duì)應(yīng)，利用打孔器從葉片上取下面積為50 cm2的圓盤葉片用于光譜圖像采集，并將整個(gè)葉片圓盤作為感興趣區(qū)域(region of interest, ROI)，用于提取平均光譜。多光譜圖像的采集參數(shù)為物鏡距離30 cm，曝光時(shí)間為35 ms，高光譜圖像的采集參數(shù)則為物鏡距離30 cm，曝光時(shí)間為30 ms，平臺(tái)移動(dòng)速度為1.0 mm·s-1。在油菜葉片的高光譜和多光譜圖像采集前，首先獲取參考板和暗電流的光譜圖像數(shù)據(jù)，用于數(shù)據(jù)處理前原始光譜圖像的校正，以減少光照不均勻和暗電流對(duì)光譜圖像的影響，校正公式為

圖1 手持式多光譜成像系統(tǒng)(a)、不同波長(zhǎng)LED的布局(b)、各個(gè)LED的中心波長(zhǎng)(c)、 上位機(jī)軟件(d)及室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)(e)

(1)

式中，R為校正后的光譜圖像，Idark為暗電流圖像，Iraw為原始光譜圖像，Iref為參考板光譜圖像。

1.3 葉綠素含量測(cè)定

在光學(xué)圖像采集后，采用傳統(tǒng)方法測(cè)量葉片中葉綠素含量[12]。將上述50 cm2的圓盤葉片浸泡在裝有8 mL 95%乙醇的離心管中。黑暗環(huán)境中靜置24 h后，使用酶標(biāo)儀 (Epoch2, BioTek Instruments, Inc, Vermont, USA)測(cè)量葉綠素溶液在470，649和665 nm的吸光度值(A470，A649和A665)，用于計(jì)算出葉片中葉綠素的濃度。

1.4 光譜重構(gòu)

光譜重構(gòu)技術(shù)是將目標(biāo)物低維的光譜值恢復(fù)高維的光譜值，達(dá)到提高分辨率和檢測(cè)精度的目的。采用偽逆法求解轉(zhuǎn)換矩陣實(shí)現(xiàn)多光譜向高光譜重構(gòu)，轉(zhuǎn)換矩陣的求解過(guò)程如式(2)—式(4)[13]

Xms=XssF

(2)

(3)

Xss,c=Xss,uF

(4)

1.5 預(yù)測(cè)模型的建立與評(píng)價(jià)

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜反射率分析

應(yīng)用室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)和手持式多光譜成像系統(tǒng)所測(cè)得所有油菜葉片的平均光譜反射率曲線如圖2(a)和(b)所示。分析圖2(a)和(b)可知，兩臺(tái)儀器測(cè)得油菜葉片平均反射率的絕對(duì)值不同； 原因可能由于兩者的傳感器響應(yīng)(室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)用的是CCD，而手持式多光譜成像設(shè)備用的是CMOS)存在差異引起的。然而進(jìn)一步分析可知，兩臺(tái)設(shè)備測(cè)得的葉片的平均光譜曲線趨勢(shì)一致，表現(xiàn)為因葉綠素和類胡蘿卜素吸收引起的在藍(lán)光(460 nm)和紅光(660 nm)區(qū)域出現(xiàn)的波谷，葉片反射綠光在520 nm引起的綠色反射峰。因“紅邊”效應(yīng)引起的在660～740 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的反射率急劇上升。由于植物對(duì)近紅外光幾乎不吸收，導(dǎo)致近紅外區(qū)域(740～940 nm)的反射率較高。圖2(c)顯示了重構(gòu)的和室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)所測(cè)的所有樣品在430～1 023 nm內(nèi)的高光譜反射率。分析圖2(c)可知，重構(gòu)的油菜高光譜反射率和室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)所測(cè)的高光譜反射率基本上處于相同的數(shù)值區(qū)間。對(duì)比分析可見(jiàn)光(430～740 nm)和近紅外(740～1 023 nm)區(qū)域的重構(gòu)效果可以看出，重構(gòu)的光譜反射率與室內(nèi)系統(tǒng)獲得的光譜反射率在可見(jiàn)光區(qū)域的重疊度高于近紅外。這可能是由于相機(jī)傳感器在可見(jiàn)光范圍內(nèi)的量子效率優(yōu)于近紅外。圖2(d)顯示了所有樣本重構(gòu)的光譜反射率和室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)測(cè)得的光譜反射率兩者之間的相關(guān)性系數(shù)(r)均可達(dá)到0.99以上，說(shuō)明了偽逆法能夠?qū)崿F(xiàn)多光譜向高光譜的重構(gòu)。

2.2 校正模型的預(yù)測(cè)性能分析

2.3 光譜重構(gòu)的效果評(píng)價(jià)

圖2 室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)獲得的所有油菜葉片的平均光譜反射率(a)，手持式多光譜成像系統(tǒng)測(cè)得的所有油菜葉片的平均光譜反射率(b)，重構(gòu)的高光譜反射率和室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)測(cè)得的葉片高光譜反射率(c)，重構(gòu)的光譜反射率和室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)測(cè)得的葉片光譜反射率之間的相關(guān)性系數(shù)(d)

圖3 基于室內(nèi)高光譜成像系統(tǒng)獲得的可見(jiàn)光范圍內(nèi)225個(gè)波段光譜反射率(a)和手持式多光譜成像系統(tǒng)獲得的可見(jiàn)光范圍內(nèi)4個(gè)波段光譜反射率建立的葉綠素PLSR模型的預(yù)測(cè)性能

圖4 不同標(biāo)樣集個(gè)數(shù)對(duì)PLSR模型預(yù)測(cè)性能的影響(a)和標(biāo)樣集為5時(shí)重構(gòu)得到的光譜建立的PLSR模型的預(yù)測(cè)效果(b)

3 結(jié) 論