絲素蛋白負(fù)電性增強(qiáng)改性及其對降鈣素基因相關(guān)肽的加載能力

宋廣州，涂芳芳，丁夢瑤，戴夢男，殷 音，董鳳林，王建南,4

(1. 蘇州大學(xué) 現(xiàn)代絲綢國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；2. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 蘇州 215123；3. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006；4. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

蠶絲是由蠶的絹絲腺合成與分泌并由吐絲口牽引而成的纖維，蛋白純度高，不含有毒成分，未接觸化學(xué)試劑。家蠶蠶絲有別于長期接觸外界環(huán)境的羊毛等蛋白質(zhì)纖維，是居家生活最具舒適親和感的紡織原料。此外，近20多年來，基于蠶絲優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，家蠶絲素纖維/蠶絲織物、再生絲素蛋白和絲膠蛋白在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用研究越來越受到關(guān)注，尤其是絲素蛋白(SF)。家蠶SF大分子由重鏈(H鏈)、 輕鏈(L鏈)和一種糖蛋白P25鏈以量比為6∶6∶1組成，H鏈占總分子量的92%，由12個(gè)疏水性的GAGAGS六肽為主的重復(fù)序列和11個(gè)親水性的非重復(fù)序列相間排列而成[1]，獨(dú)特的序列結(jié)構(gòu)可使再生SF在外在因素(溫度、溶劑、交聯(lián)劑)的誘導(dǎo)下形成穩(wěn)定結(jié)晶結(jié)構(gòu)的絲素膜、三維支架或納微球等生物醫(yī)用材料[2]。

SF具有優(yōu)異的生物相容性，支持角膜細(xì)胞[3]、成纖細(xì)胞[4]、血管細(xì)胞[5]、干細(xì)胞[6]等多種細(xì)胞的粘附、增殖或分化。SF在皮膚[7]、神經(jīng)導(dǎo)管[8]、軟骨[9]及血管[10-11]等組織工程支架方面的應(yīng)用研究很活躍。其中，研究者對蠶絲織物、再生SF納米纖維、再生SF多孔材料用于血管組織工程支架的構(gòu)建開展了深入的研究。但作為血管組織工程支架，小直徑(內(nèi)徑<6 mm)血管移植物還未實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用，主要原因是易誘發(fā)血栓形成和內(nèi)膜增生，管腔內(nèi)徑小而發(fā)生閉塞。血管內(nèi)膜是維持凝血系統(tǒng)平衡的承擔(dān)者，只有通過抑制平滑肌細(xì)胞過度增殖才能阻止內(nèi)膜增生?，F(xiàn)有研究指出，二維或三維SF材料可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，支持血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞或血管成纖細(xì)胞在內(nèi)的血管細(xì)胞共培養(yǎng)[3]，那么，如果小血管移植物植入初期內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的競爭性生長能夠得到調(diào)控尤顯重要。

降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是目前體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的舒張血管活性肽，更重要的是具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞活性的功能，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞向受損血管壁遷移，刺激細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[12-14]，因此，本文開展了CGRP修飾SF膜的研究，首先用己二酸對SF進(jìn)行改性制備了帶高負(fù)電荷的再生SF膜，進(jìn)一步探索了CGRP通過靜電相互作用在SF膜表面的加載能力，以期為SF小口徑人工血管的設(shè)計(jì)提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料：家蠶生絲，如皋春秋絲綢有限公司；己二酸(AA)，北京伊諾凱科技有限公司；透析袋(14 ku)，上海通善生物科技有限公司；溴化鋰，合肥精匯化工研究所；1-乙基-3 (3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，Sigma上海貿(mào)易有限公司；嗎啉乙磺酸(MES)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；降鈣素基因相關(guān)肽，默克密理博公司；兔抗人降鈣素基因相關(guān)肽一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的驢抗兔二抗，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；BCA試劑盒、吐溫-20和TMB顯色液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，上海源葉生物科技有限公司；小牛血清，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，上海圣納堡生物科技開發(fā)有限公司；Na2CO3，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器：PB-10型pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DF-101S型磁力攪拌器，上海予正儀器設(shè)備有限公司；DZF-6053型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Alpha 1-4 Lscplus型冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；Malvern ZS90型粒徑電位分析儀，英國Malvern公司；Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；X′Pert-Pro MPD型全自動(dòng)X射線衍射儀，荷蘭PANalytical B.V.公司；Bio-Tek型多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國BioTek公司。

1.2 試樣制備方法

1.2.1 SF溶液的制備

稱取家蠶生絲以浴比為1∶50于煮沸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%的Na2CO3水溶液中攪拌均勻，30 min后取出用去離子水洗滌干凈，重復(fù)3次。干燥后將脫膠的蠶絲纖維以浴比為3∶20溶解于9.3 mol/L溴化鋰水溶液中，于(65±2) ℃攪拌直至完全溶解。將溶解液裝入截留分子質(zhì)量為14 ku的透析袋，于 4 ℃ 去離子水中透析3 d，得到再生SF水溶液，過濾后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法濃縮至質(zhì)量濃度為40 mg/mL。

1.2.2 AA改性SF膜的制備

制備10 mg/mL的AA溶液，分別加入與AA量比為2.5∶1的EDC和NHS，攪拌均勻于4 ℃活化1 h。 向SF水溶液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的MES混合均勻，然后按SF與AA質(zhì)量比為100∶0、100∶0.5、100∶1、100∶1.5、100∶2和100∶2.5制備SF/AA混合溶液，冰浴攪拌反應(yīng)30 min。然后將反應(yīng)后的混合溶液裝入透析袋中，于4 ℃冰箱內(nèi)透析2 d。每個(gè)樣品量取一定體積脫除細(xì)小氣泡后，輕輕倒入聚苯乙烯板孔內(nèi)，于40 ℃恒溫干燥后取出，在室溫下平衡12 h揭膜，得到AA交聯(lián)改性SF膜。

1.3 測試與表征

1.3.1 熱水溶失率測試

根據(jù)SF質(zhì)量濃度和倒入板孔的體積，計(jì)算得到絲素膜中原有SF的質(zhì)量m1。所有樣品置于恒溫恒濕環(huán)境平衡24 h后逐一稱取質(zhì)量，按浴比為1∶50浸漬于去離子水中，于37 ℃水浴振蕩12 h，棄去樣品，以3 000 r/min離心5 min收集上清液。采用BCA試劑盒并根據(jù)說明書標(biāo)準(zhǔn)步驟測定上清液中SF的質(zhì)量濃度。

首先用BSA配制標(biāo)準(zhǔn)梯度質(zhì)量濃度，用酶標(biāo)儀檢測562 nm處的吸光度(OD562)，繪制曲線擬合得到回歸直線方程y=ax+b(R2≥0.99)(式中：x為BSA質(zhì)量濃度，mg/mL；y為吸光度)。同時(shí)測定各樣品的吸光度，根據(jù)y=ax+b計(jì)算各樣品的SF質(zhì)量濃度，進(jìn)一步根據(jù)浸漬的體積計(jì)算各樣品溶失的SF質(zhì)量m2。根據(jù)下式計(jì)算熱水溶失率：

S=m2/m1×100%

1.3.2 Zeta電位測試

將1.2.2節(jié)反應(yīng)透析后的SF溶液稀釋至質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，采用粒徑電位分析儀測定溶液中改性SF的Zeta 電位。

1.3.3 結(jié)構(gòu)測試

將SF膜剪成細(xì)小粉末，收集透過孔徑為50 μm網(wǎng)篩的粉末，采用傅里葉紅外光譜儀測定樣品的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子構(gòu)象。掃描次數(shù)為32，分辨率為2 cm-1，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

使用X射線衍射儀測定樣品的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，采用CuKα射線，波長為0.154 06 nm，管電壓為40 kV，管電流為35 mA，掃描速度為2(°)/min，記錄2θ在5°～50°間的X射線衍射曲線。

1.3.4 SF膜表面CGRP加載能力測試

SF膜表面加載CGRP：將SF與AA 質(zhì)量比為100∶0、100∶1和100∶2.5的改性SF膜按96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的底面積剪成小圓片并鋪于孔底部，每孔加入30 μL(180 ng)的CGRP水溶液，于4 ℃孵育12 h，然后室溫風(fēng)干，再用去離子水漂洗 2次，風(fēng)干。

CGRP加載能力測定(酶聯(lián)免疫吸附法)：每孔加入100 μL含5%小牛血清和0.05%吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)，于37 ℃孵育1 h；漂洗后加入1∶1 000稀釋的兔抗人降鈣素基因相關(guān)肽一抗40 μL，于37 ℃孵育1 h；再次漂洗后加入1∶5 000稀釋的HRP驢抗兔二抗40 μL，于37 ℃孵育1 h；漂洗后加入200 μL 的TMB溶液，于37 ℃孵育20 min；最后加入50 μL的2 mol/L 的硫酸溶液終止反應(yīng)。取上述反應(yīng)液稀釋相同倍數(shù)后，每個(gè)樣品取200 μL溶液加入到新的96孔板內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下的吸光度(OD450)值。

2 結(jié)果與討論

2.1 AA改性SF的反應(yīng)機(jī)制

有機(jī)合成和生物化學(xué)中，EDC和NHS是常用的水溶性催化交聯(lián)劑，可催化介導(dǎo)羧基和氨基偶聯(lián)成酰胺鍵[15]，反應(yīng)機(jī)制如圖1所示。EDC先活化AA端部的2個(gè)—COOH，使其充分地與SF分子上的—NH2反應(yīng)形成酰胺鍵—CONH—，交聯(lián)SF分子鏈或者接枝于SF分子鏈上。SF大分子之間也發(fā)生側(cè)基—COOH 與—NH2的共價(jià)結(jié)合形成—CONH—。整個(gè)反應(yīng)過程中，EDC和NHS只起到催化作用，形成中間體O—異?；搴蚇HS酯，再與—NH2共價(jià)結(jié)合后成為小分子副產(chǎn)物，未反應(yīng)的EDC、NHS及生成的小分子副產(chǎn)物均可通過透析或者凝膠過濾除去。

圖1 AA改性SF的反應(yīng)機(jī)制Fig.1 Reaction mechanism of AA modified SF

2.2 AA改性SF的電負(fù)性分析

Zeta電位是帶電分子或微粒表面剪切層的電位，水溶液環(huán)境下AA改性SF的Zeta電位測試結(jié)果如圖2所示?？梢?，隨著AA質(zhì)量占比的增加，改性SF的電負(fù)性逐漸增加。研究初期，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的SF與AA的最大質(zhì)量比為100∶5，但研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)AA質(zhì)量占比較大，即SF與AA質(zhì)量比為100∶3時(shí)，SF膜的成型開始受到影響，因此，確定AA添加比例最大為100∶2.5。 AA改性SF后，當(dāng)端部2個(gè)—COOH交聯(lián)反應(yīng)連接2個(gè)SF分子時(shí)，SF分子鏈上可接受質(zhì)子的伯胺—NH2基團(tuán)被反應(yīng)形成酰胺鍵—CONH—，使SF分子中—COOH數(shù)量相對增多，凈電荷負(fù)值增加；當(dāng)AA的1個(gè)—COOH接枝反應(yīng)在SF分子鏈上時(shí)，不僅與SF分子鏈上接受質(zhì)子的伯胺—NH2基團(tuán)反應(yīng)，同時(shí)還引入1個(gè)—COOH，使凈電荷負(fù)值增加。當(dāng)SF與AA的質(zhì)量比為100∶2.5時(shí)，SF溶液的Zeta電位由未改性SF溶液的-2.66 mV 下降為-5.4 mV，說明Zeta負(fù)電位值增加1倍。

圖2 水溶液環(huán)境下AA改性SF的Zeta電位Fig.2 Zeta potential of AA modified SF in aqueous solution

2.3 改性SF膜的熱水溶失率分析

對生物材料來說，水(組織液)環(huán)境不溶性是非常重要的，因?yàn)槿芙猱a(chǎn)物易引起肌體炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)。圖3示出37 ℃水環(huán)境下AA改性SF膜的熱水溶失率。

圖3 AA改性SF膜的熱水溶失率Fig.3 Hot water loss rate of AA modified SF films. (a)BSA standard curve; (b)Loss rate of SF

由圖3(a)BSA質(zhì)量濃度-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得，其回歸直線方程為y=0.545 9x+0.205 6，確定系數(shù)R2=0.996 5。由圖3(b)可知，未改性SF膜中蛋白的溶失率小于10.5%，說明SF膜具有較好的熱水穩(wěn)定性；隨著AA質(zhì)量占比的增加，SF膜的熱水溶失率進(jìn)一步減小，當(dāng)SF與AA的質(zhì)量比由100∶0 增加為100∶1時(shí)，SF的熱水溶失率下降顯著；SF與AA的質(zhì)量比為100∶1.5時(shí)，SF溶失率達(dá)到最小，隨后趨于穩(wěn)定。添加AA后，兩端活化的—COOH 連接于SF大分子使SF材料形成了更穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高了SF的耐水性。

圖4 AA改性SF膜的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of 4 000～2 000 cm-1 (a) and 2 000～1 000 cm-1 (b) of AA modified SF films

2.4 改性SF膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)與分子構(gòu)象分析

2.5 改性SF膜的結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析

SF材料主要有2種結(jié)晶結(jié)構(gòu)：Silk I和Silk Ⅱ。Silk Ⅰ(α螺旋和β轉(zhuǎn)角)結(jié)晶衍射峰主要出現(xiàn)在12.2°、19.7°、24.7°附近，Silk II(β-折疊)結(jié)晶衍射峰主要出現(xiàn)在9.1°、20.7°、24.3°附近。圖5示出AA改性SF膜的X射線衍射譜圖。可知，AA改性前后SF膜均形成了穩(wěn)定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，AA改性后SF膜在12.2°附近的Silk Ⅰ特征衍射峰消失，19.8°附近的典型結(jié)晶峰變尖銳且峰尖偏移至20.6°附近，尤其是SF與AA的質(zhì)量比為100∶1、100∶1.5和100∶2的3種SF膜，因?yàn)锳A的交聯(lián)使SF肽鏈之間形成了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了SF膜更穩(wěn)定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)的形成，但AA添加過多，也會(huì)阻礙SF肽鏈間緊密有序的排列。另外，所有SF膜在24.3°附近出現(xiàn)Silk Ⅱ的結(jié)晶峰。

圖5 AA改性SF膜的X射線衍射曲線Fig.5 X-ray diffraction curves of AA modified SF films

2.6 AA改性SF膜加載CGRP的能力分析

CGRP是1982 年采用分子生物技術(shù)和DNA基因重組技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)的生物活性多肽，含有37個(gè)氨基酸殘基，N末端和C末端均有激活受體并與受體高親和性結(jié)合的活性位點(diǎn)[16-17]。已有研究證明，不恰當(dāng)?shù)墓矁r(jià)結(jié)合反應(yīng)封閉了生物活性分子的活性位點(diǎn)而使其喪失生物活性[18-20]，通過靜電作用向生物材料中引入生物活性因子才可最有效地保護(hù)其活性。CGRP是等電點(diǎn)為9.5的表面帶正電的活性物質(zhì)，為保持CGRP活性，將AA引入SF分子鏈，使SF膜表面產(chǎn)生了更多的—COOH，溶液中—COOH失去質(zhì)子(—COO-)從而提高了表面電負(fù)性，進(jìn)一步通過靜電相互作用在SF膜表面加載CGRP，加載示意圖如圖6所示。

圖6 AA改性SF膜加載CGRP示意圖Fig.6 Schematic diagram of CGRP loading on AA modified SF films

由圖2可知，隨著AA質(zhì)量占比的增加，SF膜的負(fù)電荷也隨之增加，當(dāng)SF與AA的質(zhì)量比從100∶0 變化為100∶1和100∶2.5時(shí)，SF的Zeta電位由-2.66 mV 下降為-3.95和-5.4 mV。圖7示出AA改性SF膜上CGRP的加載能力?？芍弘S著SF膜表面負(fù)電荷的增加，因靜電作用加載于膜表面的CGRP量逐漸增多，SF與AA質(zhì)量比為100∶1的AA改性SF膜表面CGRP的加載量是未改性SF膜的1.22倍；當(dāng)SF與AA質(zhì)量比為100∶2.5時(shí)，改性膜表面CGRP的加載量有顯著提高，達(dá)到未改性SF膜的9倍。

注：**表示p< 0.01。圖7 AA改性SF膜上CGRP的加載能力Fig.7 Loading capacity of CGRP on AA modified SF films

3 結(jié) 論

降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種具有調(diào)控血管舒張和血管細(xì)胞競爭性生長的活性肽，分子表面帶正電。為加載更多的CGRP，并保護(hù)CGRP分子中功能區(qū)域的側(cè)基官能團(tuán)的活性，選擇帶有2個(gè)—COOH 端的己二酸(AA)對絲素蛋白(SF)進(jìn)行改性，使SF表面的負(fù)電荷得到顯著的增加，大大提高了對CGRP的靜電加載能力。當(dāng)SF與AA的質(zhì)量比從100∶0變化為100∶2.5 時(shí)，SF的Zeta負(fù)電位值增加1倍，SF膜表面CGRP的加載量增加9倍。 本文研究對SF用于小口徑血管組織工程材料的開發(fā)與功能改性具有重要的參考作用。