兒童感染后閉塞性細(xì)支氣管炎早期外周血中淋巴細(xì)胞亞群分析

李林瑞，張喜，陳艷萍

閉塞性細(xì)支氣管炎(bronchiolitis obliterans，BO)是一種與小氣道尤以細(xì)支氣管炎癥損傷相關(guān)的氣道阻塞性病變所致的氣流不暢的疾病，病理學(xué)檢查是其最可靠的診斷依據(jù)。其發(fā)生與多種因素相關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞及上皮下結(jié)構(gòu)炎癥、損傷后免疫反應(yīng)與之相關(guān)。Mauad和Dolhnikoff[1]對(duì)30例開(kāi)胸肺活檢的感染后閉塞性細(xì)支氣管炎(post-infectious bronchiolitis obliterans，PIBO)患者進(jìn)行病理學(xué)分析，縮窄性細(xì)支氣管炎占97%，而巨噬細(xì)胞聚集、支氣管擴(kuò)張、黏液分泌少、過(guò)度充氣等閉塞的間接征象常出現(xiàn)。

感染是兒童BO最常見(jiàn)的原因，其中腺病毒是最常見(jiàn)的病原體，其他如麻疹病毒、支原體、B型鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、百日咳桿菌、流感病毒也可能導(dǎo)致BO。在重癥感染患兒中，有一部分患兒可進(jìn)展為BO。臨床上BO的診斷主要依靠胸部高分辨CT檢查[2]，但是對(duì)于BO病情的進(jìn)展并無(wú)明顯評(píng)估優(yōu)勢(shì)。因此探尋重癥肺炎患兒中BO發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素，對(duì)于早期識(shí)別BO和預(yù)后具有重要的意義。本研究首次在兒童重癥腺病毒感染后早期進(jìn)行回顧性分析，探討其外周血中免疫細(xì)胞變化與BO發(fā)展的相關(guān)性，為早期識(shí)別BO提供重要參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年6月至2018年6月在湖南省兒童醫(yī)院住院的、入院初期診斷為重癥肺炎的患兒48例，24例通過(guò)咽拭子呼吸道病毒抗原檢測(cè)(膠體金法)確定腺病毒感染后BO患兒為觀察組，其中男18例，女6例；年齡0.5～4歲，平均1.7歲。同期選取重癥肺炎未進(jìn)展為BO的患兒24例為對(duì)照組，其中男17例，女7例；年齡0.6～3歲，平均1.6歲。兩組患兒在性別、年齡方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照目前較為公認(rèn)的BO的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。重癥肺炎評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第8版中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合BO和重癥肺炎的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡0～4歲；(3)本研究已通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫委員會(huì)審核及患兒家長(zhǎng)知情同意。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 其他引起咳喘的疾病，如呼吸道感染、支氣管哮喘、各種先天支氣管肺發(fā)育畸形、肺結(jié)核、彌漫性泛細(xì)支氣管炎等。

1.5 方法 兩組患兒均于入院后采集靜脈血，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，室溫放置，24 h內(nèi)處理，處理前充分混勻。采用FACSCanto Clinical六色免洗淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，得出血中CD4、CD8、B、T以及自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的絕對(duì)數(shù)。

2 結(jié)果

兩組患兒外周血經(jīng)流式細(xì)胞數(shù)測(cè)定，分別獲CD4、CD8、B、T以及NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)，分別經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)均為非正態(tài)分布，因此采用中位數(shù)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和比較。其中兩組全血總T淋巴細(xì)胞及總B淋巴細(xì)胞數(shù)目及比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組CD4細(xì)胞數(shù)及其比值均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組CD8細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是觀察組CD8細(xì)胞比值高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；觀察組NK細(xì)胞數(shù)及其比值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組CD4/CD8比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1,2。

表1 兩組T、B、CD4、CD8及NK細(xì)胞亞群絕對(duì)數(shù)比較[個(gè),M(P25～P75)]

表2 兩組T、B、CD4、CD8及NK細(xì)胞亞群比值比較[M(P25～P75)]

3 討論

1901年德國(guó)病理學(xué)家Lange通過(guò)對(duì)患者肺組織病理分析，首次提出了BO的概念[6]。BO發(fā)病機(jī)制仍未明確，目前最被認(rèn)可的是炎癥及免疫反應(yīng)。感染是兒童BO最常見(jiàn)的原因，其中腺病毒是最常見(jiàn)的病原體。腺病毒進(jìn)入機(jī)體激活巨噬細(xì)胞，釋放多種炎癥因子，引起的全身炎癥反應(yīng)造成部分不可逆損傷。腺病毒E1A蛋白激活轉(zhuǎn)錄因子，使得宿主炎癥相關(guān)基因過(guò)度表達(dá)而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)；作為無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，腺病毒特定的病毒蛋白能阻斷細(xì)胞因子的抗炎反應(yīng)，減輕機(jī)體免疫應(yīng)答，影響抗原提呈和減少感染細(xì)胞T細(xì)胞攻擊[7]。張喜等[8]研究發(fā)現(xiàn)32例腺病毒感染肺炎患兒中，其中6例隨訪患兒出現(xiàn)閉塞性細(xì)支氣管炎。表現(xiàn)對(duì)移植后BO患者的免疫學(xué)病因研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞直接損傷移植肺和間接肺內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致移植相關(guān)BO最重要的因素[9]。

目前對(duì)于兒童BO發(fā)生發(fā)展中免疫因素的研究尚少。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，兒童感染后BO外周血白細(xì)胞介素-4(IL-4)中輕度組患兒的IL-4表達(dá)顯著低于重度組，隨著病情進(jìn)展IL-4表達(dá)水平顯著升高，因此監(jiān)測(cè)IL-4表達(dá)水平能夠反映出患兒BO的進(jìn)展程度[10]。在特異性抗原的刺激下，CD4+T細(xì)胞在不同細(xì)胞因子作用下分化為Th1和Th2兩種極型，并因此而影響細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的平衡，調(diào)控Th1/Th2平衡的因素很多，但白細(xì)胞介素-12、γ干擾素、IL-4發(fā)揮的作用更加突出[11]。由此可看出，在BO發(fā)展過(guò)程中，IL-4通過(guò)對(duì)CD4+T細(xì)胞的分化調(diào)控起到重要的作用。所以在BO的發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞免疫起到了重要作用。

在重癥肺炎患兒中如何早期判斷該患兒是否會(huì)繼發(fā)BO，對(duì)于早期識(shí)別BO和預(yù)后具有重要的意義。Colom等[12]對(duì)125例慢性肺疾病患者進(jìn)行隊(duì)列研究后，制定出PIBO的臨床預(yù)測(cè)模型：腺病毒感染3分、典型的臨床病史4分、高分辨CT可見(jiàn)馬賽克灌注征4分；總分高于7分可診斷。而在這個(gè)預(yù)測(cè)模型中，尚未有客觀指標(biāo)參與。本研究首次探討淋巴細(xì)胞亞群數(shù)值的改變與在重癥肺炎患兒是否會(huì)早期發(fā)展成BO的相關(guān)性。通過(guò)患者及對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群分類計(jì)數(shù)研究，以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示在兒童感染后BO在發(fā)生重癥肺炎早期患兒外周血CD4細(xì)胞數(shù)低于隨訪未發(fā)生BO患兒，與陳永英等[10]研究結(jié)果一致，同時(shí)發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞數(shù)亦低于對(duì)照組，以此推測(cè)，通過(guò)外周血淋巴細(xì)胞亞群分析中發(fā)現(xiàn)CD4細(xì)胞數(shù)及NK細(xì)胞數(shù)低下也許可預(yù)測(cè)重癥肺炎患兒是否會(huì)繼發(fā)BO，考慮可能與肺部重癥感染后對(duì)免疫抑制相關(guān)。本研究中發(fā)現(xiàn)，伴隨著CD4細(xì)胞數(shù)的下降，CD4/CD8比值下降在重癥肺炎早期也有所體現(xiàn)。一項(xiàng)國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)，在感染后BO中，CD3+T細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，CD4/CD8比值處于下限；而在移植后BO中，CD8+T細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，能夠釋放有毒化合物[13],與本研究中發(fā)現(xiàn)BO CD4/CD8比值低下的結(jié)論是一致的。但本研究首次在重癥肺炎早期進(jìn)行回顧性對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)CD4細(xì)胞數(shù)及CD4/CD8比值，以及NK細(xì)胞數(shù)及比值的差異性，從而為在重癥肺炎早期發(fā)現(xiàn)是否進(jìn)展為PIBO提供可能的識(shí)別參數(shù)。本研究目前的樣本量較小，還需要通過(guò)較大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證，以對(duì)早期識(shí)別BO的CD4細(xì)胞、NK細(xì)胞等具體閾值進(jìn)行界定。