血循環(huán)腫瘤細(xì)胞及循環(huán)游離DNA在乳腺癌臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

娜 仁，賈永峰

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

乳腺癌是一種以乳房腫塊、乳頭溢液和腋窩淋巴結(jié)腫大等為臨床特征的常見婦科惡性腫瘤，流行病學(xué)研究顯示，2018年全球185個(gè)國家和地區(qū)新增乳腺癌患者208.9萬例，其中52.9%在發(fā)展中國家；死亡62.7萬例，位于癌癥死亡率的第五位，給患者的身體健康造成嚴(yán)重威脅[1，2]。隨著診療水平的不斷提高，乳腺癌患者的生存期明顯延長，但因腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的影響，其死亡率仍居高不下[3]。因此，尋找與疾病病理生理學(xué)相關(guān)的標(biāo)志物，對乳腺癌的早期診斷、腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的早期識別具有重要意義。近年來研究證實(shí)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTCs)和循環(huán)游離DNA(cell-free DNA，DNA)參與了腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移過程，對乳腺癌的臨床診斷、治療方案的制定及預(yù)后評估具有重要價(jià)值[4，5]。本文主要就CTCs、cfDNA在乳腺癌臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 CTCs、cfDNA概述

1.1 CTCsCTCs是一種因腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落侵入機(jī)體外周血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，早在1869年Ashworth[6]就在1例乳腺癌患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了CTCs。CTCs具有與腫瘤異質(zhì)性相關(guān)的抗原蛋白質(zhì)和遺傳變異表達(dá)，這一特性使CTCs成為“液體活檢”的重要檢測指標(biāo)，可為臨床腫瘤的診斷和檢測治療提供準(zhǔn)確信息[7]。多項(xiàng)臨床研究表明，除乳腺癌外，CTCs也在卵巢癌、結(jié)直腸癌和肺癌等腫瘤疾病的診療中發(fā)揮重要作用，有望成為腫瘤疾病診斷及實(shí)時(shí)療效評估的標(biāo)志物[8～10]。

1.2 cfDNAcfDNA是循環(huán)體液中游離于細(xì)胞外的高度片段化DNA，主要由凋亡、壞死或正常的細(xì)胞主動或被動裂解后釋放出，在健康人群血漿中含量較少(1～100 ng/ml)，片段較短(166 pb)[11]。腫瘤患者因核酸酶活性降低，導(dǎo)致cfDNA的清除率下降，故患者血漿中cfDNA一般呈高水平表達(dá)狀態(tài)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，cfDNA可攜帶相關(guān)細(xì)胞來源的遺傳信息，能夠在一定程度上反映實(shí)體腫瘤組織中的基因突發(fā)圖譜頻率，有利于腫瘤的早期診斷、療效評價(jià)及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[13]。此外，cfDNA半衰期較短，與常規(guī)的血清腫瘤標(biāo)志物相比，更有利于腫瘤的實(shí)時(shí)動態(tài)監(jiān)測[14]。

2 CTCs、cfDNA的檢測方法

2.1 CTCs的研究手段相關(guān)動物模型實(shí)驗(yàn)研究[15]發(fā)現(xiàn)，腫瘤疾病發(fā)展過程中，大量腫瘤細(xì)胞被釋放至血液循環(huán)中形成CTCs。但受血流剪切力、自身免疫系統(tǒng)和失巢凋亡效應(yīng)的影響，僅有少數(shù)腫瘤細(xì)胞能逃過宿主免疫攻擊，成功侵入遠(yuǎn)處器官，最終形成轉(zhuǎn)移病灶，故外周血中CTCs的數(shù)量極少[16]。為提高CTCs的檢出率，在檢測前通常對CTCs進(jìn)行富集，相關(guān)富集方法主要有密度梯度離心法、濾過分離法、免疫磁珠分離法、流式細(xì)胞術(shù)、Can Patrol系統(tǒng)和液滴微流體技術(shù)等。其中，密度梯度離心法、濾過分離法和免疫磁珠分離法是第一代檢測方法，主要根據(jù)CTCs的密度、體積、表面電荷等特點(diǎn)進(jìn)行分離[17]。流式細(xì)胞術(shù)和Can Patrol系統(tǒng)屬于第二代檢測方法，Can Patrol系統(tǒng)結(jié)合了納米技術(shù)和多重RNA原位分析技術(shù)，在提高CTCs回收率的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了對所有腫瘤表型CTCs的分離與鑒定[18]。液滴微流體技術(shù)是在第二代基礎(chǔ)上研發(fā)出來的可對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離的技術(shù)，該技術(shù)中，每個(gè)液滴均可作為獨(dú)立的微反應(yīng)器，大大降低了樣品與試劑的消耗，檢測敏感性和特異性更高，目前相關(guān)報(bào)道主要見于在肺癌中的臨床應(yīng)用[19]。在乳腺癌研究中，常用的檢測方法主要包括流式細(xì)胞術(shù)、Cell Search系統(tǒng)、免疫熒光原位雜交和液滴微流體技術(shù)等。

2.2 cfDNA的研究手段單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR法、限制性片段長度多態(tài)性PCR法是既往常用的cfDNA檢測方法，但由于其檢測敏感度較低，逐漸被數(shù)字PCR法和測序技術(shù)取代。數(shù)字PCR法是一種核酸分子絕對定量技術(shù)，該技術(shù)將單個(gè)DNA于微反應(yīng)器中進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)反應(yīng)器呈現(xiàn)的不同熒光信號，結(jié)合相對比例和反應(yīng)器體積計(jì)算出cfDNA原始濃度，從而實(shí)現(xiàn)cfDNA的絕對定量檢測[20]。數(shù)字PCR法無需擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測速度較快，具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但其局限性在于僅能對cfDNA已知的突變類型進(jìn)行分析。測序技術(shù)可對指定區(qū)域或全部基因進(jìn)行深度分析，以獲取更多的腫瘤基因遺傳多態(tài)性信息。當(dāng)前常用的標(biāo)記擴(kuò)增深度測序、癌癥個(gè)體化深度測序等均屬于第二代測序技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，在保證cfDNA足量的情況下，檢測靈敏度、特異度與測量深度呈明顯正相關(guān)，所獲取的腫瘤遺傳信息也隨著測序深度的升高逐漸增多，但檢測成本及時(shí)間也隨之增加[13]。因此，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)研究目的及材料進(jìn)行選擇。

3 CTCs、cfDNA檢測在乳腺癌中的臨床應(yīng)用

3.1 CTCs、cfDNA與乳腺癌的早期診斷乳腺癌早期幾乎無明顯癥狀，傳統(tǒng)影像學(xué)檢查在疾病早期無法及時(shí)識別，存在漏診的風(fēng)險(xiǎn)。而早期乳腺癌的5年生存期遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于晚期，若及時(shí)對乳腺癌進(jìn)行鑒別診斷，并接受積極的治療，患者的總體生存率及預(yù)后質(zhì)量可明顯提高[21]。因此，早期診斷對乳腺癌的治療及預(yù)后具有重要意義。CTCs、cfDNA檢測是乳腺癌診斷極具潛在價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)，張瀟分等[22]研究了47例乳腺癌患者外周諸血CTCs、cfDNA表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的CTCs水平為(13.98±12.36)個(gè)/ml，血漿cfDNAAlu247/115指數(shù)水平為(0.769±0.387)，均明顯高于良性乳腺疾病患者和健康體檢者；當(dāng)CTCs截?cái)嘀禐?.68個(gè)/ml時(shí)，診斷靈敏度、特異度分別為80.4%、96.4%；cfDNAAlu247/115截?cái)嘀等?.431時(shí)，診斷靈敏度、特異度分別為71.7%%、71.4%，而二者聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高檢測效率。Jin等[23]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者的CTCs陽性表達(dá)率明顯高于良性乳腺疾病患者和健康者，且CTCs的表達(dá)水平與乳腺癌患者的腫瘤類型、分期、大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，認(rèn)為CTCs可作為乳腺癌篩查和分期診斷的輔助指標(biāo)。Winn等[24]采用靶向測序技術(shù)檢測19例乳腺癌患者的血漿cfDNA水平，發(fā)現(xiàn)cfDNA中測得的基因圖譜與腫瘤組織的基因圖譜是互補(bǔ)的，可見cfDNA對乳腺癌具有良好的診斷價(jià)值。

3.2 CTCs、cfDNA與乳腺癌的治療及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌的臨床治療以精準(zhǔn)化及綜合性為治療原則，根據(jù)患者的身體狀況及腫瘤生物學(xué)特征，主要采用藥物治療、放療、手術(shù)治療或多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用等[25]，如何多元評價(jià)療效、準(zhǔn)確預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，以避免無用的毒性治療，為臨床治療方案的制定提供補(bǔ)充信息，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。徐彬等[26]對6例接受手術(shù)治療的乳腺癌患者的外周血CTCs表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)與術(shù)前相比，3例T2期乳腺癌患者術(shù)后3、6個(gè)月時(shí)的CTCs水平呈現(xiàn)下降趨勢，且均為出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；3例T3期乳腺癌患者術(shù)后3、6個(gè)月時(shí)的CTCs水平呈升高趨勢，術(shù)后均出現(xiàn)了復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提示CTCs高檢出率與患者手術(shù)療效、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)。NI等[27]應(yīng)用CanPatrolTM技術(shù)對接受新輔助化療的早期乳腺癌患者的CTCs水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)新輔助化療后CTCs陽性患者由29例減少到8例，其中化療方案EC-T(表阿霉素/環(huán)磷酰胺+多西紫杉醇)、TEC(多西紫杉醇/表阿霉素/環(huán)磷酰胺)分別將CTCs陽性患者從16例、13例減少到3例、5例，且CTCs的轉(zhuǎn)陰率與客觀緩解率存在明顯相關(guān)性。一項(xiàng)有關(guān)CTCs、cfDNA檢測對局部晚期乳腺癌患者新輔助化療療效的預(yù)測研究[28]顯示，存在高客觀緩解率的患者，其CTCs、cfDNAAlu11濃度與治療前持平，無明顯增加；而低客觀緩解率患者的CTCs、cfDNAAlu11濃度在新輔助化療期間持續(xù)增加，認(rèn)為新輔助治療過程中，cfDNA濃度變化趨勢與CTCs相似，二者均可作為預(yù)測乳腺癌治療療效的有效指標(biāo)。

3.3 CTCs、cfDNA與乳腺癌的預(yù)后癌坯抗原、糖類抗原125等血清腫瘤標(biāo)志物是臨床常用的乳腺癌預(yù)后評估指標(biāo)，但由于缺乏權(quán)威的證據(jù)支持，臨床不建議將其應(yīng)用于乳腺癌的術(shù)后隨訪復(fù)查及預(yù)后評估中[29]。2018年，美國癌癥聯(lián)合委員會指南在激素受體、人表皮生長因子受體2、細(xì)胞增殖因子Ki67和腫瘤組織學(xué)分級的基礎(chǔ)上，將CTCs列為乳腺癌預(yù)后評估指標(biāo)[30]。馬有龍等[31]研究證實(shí)CTCs陽性表達(dá)率與中晚期乳腺癌化療患者的預(yù)后存在相關(guān)率，他發(fā)現(xiàn)化療敏感患者化療4周后、研究終點(diǎn)時(shí)的外周血CTCs陽性率明顯低于化療不敏感患者，且CTCs對患者預(yù)后的預(yù)測具有較高的靈敏度和特異度。Aguilar等[32]評估了27例轉(zhuǎn)移性乳腺癌化療患者cfDNA基因組不穩(wěn)定性(genomic instability，GIN)，研究發(fā)現(xiàn)隨著GIN的升高，患者總生存期(OS)有降低的趨勢，治療后3周的高GIN值與患者的OS、進(jìn)展生存期(PFS)惡化顯著相關(guān)；GIN值在疾病穩(wěn)定患者中的下降程度明顯高于進(jìn)展患者。以上結(jié)果表明，治療早期對乳腺癌患者cfDNA的GIN值進(jìn)行檢測，有利于患者PFS和OS的預(yù)測。一項(xiàng)Meta分析研究[33]也發(fā)現(xiàn)，cfDNA與乳腺癌的進(jìn)展生存期、總生存期較短顯著相關(guān)；亞組分析結(jié)果顯示，cfDNA是預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的良好指標(biāo)。

4 總結(jié)與展望

近年來，隨著對CTCs、cfDNA研究的深入，有關(guān)其在腫瘤的早期診斷、用藥指導(dǎo)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測及預(yù)后評估中已取得較大進(jìn)展。盡管CTCs檢測前的富集操作大大提高了CTCs的檢出率，但受不同分子學(xué)方法檢測CTCs的異質(zhì)性影響，以及內(nèi)外部質(zhì)量控制的影響，乳腺癌CTCs的檢測方法尚未達(dá)成共識，陽性率差別較大；當(dāng)前，cfDNA檢測仍處于研究階段，二代測序技術(shù)雖可做到高通量，但全外顯子組測序成本較高高，難以在臨床應(yīng)用中推廣，且該技術(shù)的應(yīng)用缺乏規(guī)范化的管理，仍需大規(guī)模、前瞻性臨床研究驗(yàn)證其可行性。在未來的研究中，一方面應(yīng)開展多中心大樣本調(diào)研，為CTCs、cfDNA在乳腺癌的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)；另一方面應(yīng)進(jìn)一步篩選敏感度和特異度更高的生物學(xué)指標(biāo)，與CTCs、cfDNA進(jìn)行聯(lián)合檢測，在實(shí)現(xiàn)乳腺癌早期診斷的同時(shí)，為乳腺癌的治療提供精確靶點(diǎn)，從而提高治療有效性。