皮膚自體熒光檢測技術(shù)在疾病診斷中的應用

郭林秀美，章一新

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科，上海200011

皮膚是人體最大的器官，由表皮、真皮（包括乳頭狀真皮和網(wǎng)狀真皮）及皮下脂肪組成，還包含豐富的血管、淋巴管、神經(jīng)、肌肉及各種皮膚附屬器，承擔著防御、感覺、吸收、分泌排泄和體溫調(diào)節(jié)等重要作用［1-2］。皮膚內(nèi)的部分分子（包括細胞內(nèi)及細胞外）可以吸收特定波長的入射光（也稱為激發(fā)光）進入激發(fā)態(tài)，并迅速發(fā)射波長更長的光重新回到基態(tài)，產(chǎn)生的發(fā)射光即為皮膚自體熒光（skin autofluorescence，SAF）；這些分子被稱為內(nèi)源性熒光團。目前已知的皮膚內(nèi)源性熒光團有卟啉（porphyrin）、晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）、黃素、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）、苯丙氨酸、色氨酸、膠原蛋白、彈性蛋白、脂褐素和角蛋白等［3］。熒光團具有2種特征光譜，即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。激發(fā)光譜為固定發(fā)射光波長后，熒光強度隨激發(fā)光波長變化的光譜；而發(fā)射光譜為特定波長激發(fā)光下，產(chǎn)生的發(fā)射光的熒光強度在不同波長處的分布情況。這些光譜中熒光強度達到峰值處的波長構(gòu)成了熒光團的激發(fā)/發(fā)射對（λexcitation/λemission，λEX/λEM）［4］。由于每種熒光團的λEX/λEM是特定的，因此自體熒光顯像及自體熒光光譜具有作為皮膚組織病理及生理狀態(tài)的分子標記的功能。

目前，包含自體熒光顯像及自體熒光光譜的SAF 檢測技術(shù)已在多種疾病上顯示出其獨有的優(yōu)勢及作用。本文對其在皮膚病診斷中的應用做出總結(jié)，并介紹了該技術(shù)在有AGEs累積的其他系統(tǒng)疾病中的應用。

1 炎癥性皮膚病

1.1 銀屑病

銀屑病是最常見的慢性炎癥性皮膚病之一，由炎癥及自身免疫共同介導［5］，典型的病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細胞的異常增殖和功能障礙，樹突狀細胞、巨噬細胞、T細胞和嗜中性粒細胞等炎癥細胞浸潤及新生血管形成［6］。Bissonnette 等［7］及Wang 等［8］分 別 使 用 波 長442 nm 及（405±10）nm 的激發(fā)光照射銀屑病患者病變及非病變部位的皮膚發(fā)現(xiàn)，病變部位皮膚的發(fā)射光光譜中在635 nm處有一熒光發(fā)射峰，且其峰值熒光強度與銀屑病病變嚴重程度呈正相關(guān)（r=0.627 5，P=0.002），而非病變部位的皮膚和其他皮膚病患者無此峰值；產(chǎn)生熒光發(fā)射峰的原因是患者病變部位的鱗屑中原卟啉Ⅸ（protoporphyrinⅨ，PpⅨ）的水平升高。因此，SAF 檢測可作為銀屑病診斷及療效評估的工具。

1.2 特應性皮炎

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種慢性、復發(fā)性、炎癥性皮膚病，以劇烈瘙癢和濕疹為主要表現(xiàn)，可發(fā)生于所有年齡段，但在兒童中高發(fā)（兒童患病率15%～20%）［9］。目前尚無公認的診斷AD的組織或血液生物標志物，主要依靠臨床表現(xiàn)、家族史和既往病史診斷。但對于部分臨床表現(xiàn)不典型的患者，尤其是嬰幼兒，皮損處有時表現(xiàn)為苔蘚樣改變，易與銀屑病混淆而造成誤診，需要通過皮膚活檢方可鑒別這2類疾?。?0-11］。Yim等［12］發(fā)現(xiàn)這2類疾病的病變部位在408 nm波長的激發(fā)光下產(chǎn)生的熒光光譜有顯著不同：AD患者病變部位的SAF在620 nm、530 nm和470 nm波長處的熒光強度及總體熒光強度均低于非病變部位（P=0.000 8，P=0.000 7，P=0.000 5，P=0.000 3），并在620 nm、530 nm波長處的熒光強度及總體熒光強度低于健康對照（P=0.000 0，P=0.000 0，P=0.000 0）；而銀屑病患者病變部位的SAF在620 nm波長處的熒光強度顯著高于健康對照（P=0.011 9），但在530 nm和470 nm波長處的熒光強度及總體熒光強度均與非病變部位和健康對照差異無統(tǒng)計學意義；這可能是AD患者病變部位水腫和表皮中的海綿狀變性、真皮炎癥細胞浸潤導致內(nèi)源性熒光團（例如角蛋白和膠原蛋白）的含量降低所致。因此，SAF檢測可為無創(chuàng)鑒別這2類疾病提供思路。

1.3 接觸性皮炎

接觸性皮炎指皮膚黏膜接觸某些外源性物質(zhì)后，在接觸部位發(fā)生的急慢性炎癥反應。根據(jù)發(fā)病機制的不同可將其分為刺激性接觸性皮炎（irritant contact dermatitis，ICD）和變應性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）。目前，臨床上主要根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)及斑貼試驗等區(qū)分。ICD 患者多自覺灼痛，而ACD 患者則以皮損處瘙癢為主要表現(xiàn)，但ICD 和ACD 的皮損均邊界清晰，而且同一患者可能同時存在ICD 和ACD，因此僅從病史及臨床表現(xiàn)上鑒別較為困難；而斑貼試驗操作復雜、耗時長，且目前尚無明確的生物標志物可輔助診斷［13］。Shin 等［14］發(fā)現(xiàn)使用408 nm 激發(fā)光照射CD 患者的病變部位及正常皮膚組織，不論是ICD 患者還是ACD 患者，病變部位產(chǎn)生的熒光強度都低于正常皮膚，這可能與角質(zhì)層破壞和真皮層的炎癥浸潤有關(guān)；而ICD 和ACD 病變部位的熒光強度無明顯差異，說明單純SAF檢測在鑒別這2種類型的皮炎上尚存在局限性。而在斑貼試驗結(jié)果可疑時，臨床醫(yī)師可通過觀察斑貼試驗檢測部位在408 nm 激發(fā)光產(chǎn)生的熒光照片對結(jié)果進行判定（陽性標準為照片的4 個角中3 個及以上或整張照片面積的50%～70%以上顏色較深），從而提高診斷的準確性［15］。

2 皮膚傷口愈合

皮膚傷口愈合是一個由多種細胞及細胞因子參與的復雜過程，涉及炎癥反應、上皮化、肉芽組織形成、血管再生、傷口收縮和基質(zhì)重塑等［16］。目前臨床評估傷口愈合除肉眼觀察大體表現(xiàn)外，常需進行組織活檢、針吸等侵入性操作，這可能會導致進一步的組織損傷和傷口延遲愈合［17］。Wang 等［18］建立了體外人皮膚創(chuàng)面愈合模型，傷口部位真皮層中胃蛋白酶分解的膠原交聯(lián)產(chǎn)生的自體熒光［λEX（335 nm）/λEM（390 nm）］可定量評估傷口大小、閉合程度和間隙，而分布于表皮層的色氨酸產(chǎn)生的自體熒光［λEX（295 nm）/λEM（340 nm）］可評估表皮細胞增殖和定量評估上皮化的狀態(tài)。盡管上述實驗為體外實驗，但為SAF檢測技術(shù)應用在無創(chuàng)性評估人體皮膚傷口愈合程度提供了思路。在基質(zhì)重塑階段，傷口處的細胞外基質(zhì)大量合成并沉積，形成瘢痕。Zhao等［19］在體外實驗中比較了瘢痕患者的全厚皮片和瘢痕活檢組織發(fā)現(xiàn)，在488 nm激發(fā)光下，瘢痕組織的熒光強度在548 nm 處達到峰值（176.71±20.69），而正常皮膚真皮乳頭層及網(wǎng)狀層在該波長處的熒光強度分別為103.91±15.23和169.24±9.18；使用熒光顯微鏡觀察瘢痕切片可在自體熒光背景下清楚地顯示膠原纖維的結(jié)構(gòu)，包括其松散度、厚度、邊界、大小和形態(tài)差異，這可為傷口愈合后瘢痕組織的纖維化程度評估提供一個簡單有效的方法和指標。Viktoriya等［20］通過測量正常瘢痕、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩患者瘢痕部位及正常皮膚中的自體熒光強度，發(fā)現(xiàn)脂褐素［λEX（535 nm）/λEM（585 nm）］的減少可作為診斷瘢痕疙瘩的指標之一，并獲得高達81.8%的敏感度和93.9%的特異度。由于瘢痕疙瘩患者的正常皮膚中也存在脂褐素含量的降低，因此SAF檢測還可以運用于術(shù)前預測瘢痕疙瘩形成的風險并指導手術(shù)方案的制定。

3 皮膚老化及光老化

皮膚隨著時間流逝逐漸變化的過程為時序老化，同時皮膚長期暴露于外界紫外線環(huán)境產(chǎn)生的老化，被稱為光老化［21］。皮膚時序老化及光老化均表現(xiàn)出表皮內(nèi)角質(zhì)形成細胞增殖減少、表皮-真皮交接處變平、黑素細胞減少、色素沉著及色素不均，真皮內(nèi)膠原蛋白生成減少及彈性纖維結(jié)構(gòu)破壞等［22］。

3.1 時序老化

時序老化在295 nm 激發(fā)光下產(chǎn)生的發(fā)射光的熒光強度降低，與表皮內(nèi)角質(zhì)形成細胞增殖減少所致的色氨酸含量減少有關(guān)，而在335～340 nm 激發(fā)光下產(chǎn)生的發(fā)射光的熒光強度增加，與胃蛋白酶分解的膠原蛋白增加有關(guān)［23］。Na 等［24］在對人體無紫外線暴露的臀部皮膚的色素沉著及發(fā)紅進行校正后發(fā)現(xiàn)，其在λEX（330 nm）/λEM（375 nm）時的熒光強度與年齡呈正相關(guān)（r2=0.25，P=0.002）， 每 年 增 加 約2%； 而 在λEX（370 nm）/λEM（455 nm）時的熒光強度則與年齡無關(guān)，此處的熒光主要由膠原酶分解的膠原蛋白交聯(lián)產(chǎn)生［25］。然而，Sandby-M?ller 等［26］采用同樣的方法發(fā)現(xiàn)，受試者的前額、前臂背側(cè)、肩膀及臀部皮膚在λEX（370 nm）/λEM（455 nm） 時的熒光強度均與年齡呈正相關(guān)（r2=0.08～0.26，P<0.001），而上述部位皮膚在λEX（330 nm）/λEM（370 nm）時則沒有這種年齡依賴性。這些研究的結(jié)果并不完全一致，但總的來說，年齡會導致膠原蛋白交聯(lián)相關(guān)的SAF 增加。因此，SAF 技術(shù)未來可用于校準或量化皮膚老化，如非侵入性地監(jiān)測糖尿病等疾病相關(guān)的皮膚過早老化等。

3.2 光老化

皮膚長期暴露于紫外線會誘導激發(fā)光譜中270 nm和305 nm 處的新熒光團的出現(xiàn)，這可能與慢性光損傷和炎癥反應相關(guān)［23］。急性紫外線A （ultraviolet A，UVA）暴露則表現(xiàn)為激發(fā)光譜中295 nm 處熒光強度增加而335 nm 處熒光強度降低，這種變化代表對光暴露的急性反應［4］，且其先于組織學改變，可用于急性光損傷的早期評估。Togsverd-Bo 等［27］對30 位器官移植后的患者進行分析發(fā)現(xiàn)，在370 nm 處激發(fā)的熒光強度與紫外線暴露程度及皮膚光損傷導致的曬斑的密度有關(guān)，因此該處的熒光強度可作為臨床上客觀量化光損傷的指標，并可為器官移植后患者的光老化加速提供可靠的預測指標。

4 皮膚惡性腫瘤

皮膚惡性腫瘤包括惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）及非黑色素瘤皮膚癌（non-melanoma skin cancer，NMSC），其中NMSC 又分為鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC） 和基底細胞癌（basal cell carcinoma，BCC）等類型。由于腫瘤細胞和周圍正常皮膚細胞的增殖分化以及代謝明顯不同，因此腫瘤組織與正常皮膚的SAF 存在差異，可輔助診斷皮膚惡性腫瘤。外源性光敏劑在皮膚惡性腫瘤臨床顯像中已有應用，如PpⅨ可作為NMSC 檢測和光動力療法的光敏劑。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是PpⅨ的可溶性前體，局部外敷含ALA 的乳膏約3 h 后，ALA 可被有核細胞吸收并經(jīng)血紅素合成途徑轉(zhuǎn)化為PpⅨ；腫瘤組織內(nèi)的血紅素合成相對較高，因此積累了更多的PpⅨ并得以與正常組織區(qū)分［28］。而Na等［29］證明BCC病變部位的皮膚在370 nm 激發(fā)光下產(chǎn)生的SAF在455 nm 處達到峰值，其峰值熒光強度較正常皮膚明顯降低（P<0.001），可能與NADH、膠原蛋白、彈性蛋白等熒光團的減少有關(guān)，可以代替PpⅨ誘導的熒光對腫瘤邊界進行界定。由于SAF 可直接測量而無需提前施用外源性光敏劑，因此可減少腫瘤切除的術(shù)前準備時間。Brancaleon 等［30］檢測了BCC 及SCC 患者病變部位的SAF 強度發(fā)現(xiàn)，在295 nm的激發(fā)光下，腫瘤部位色氨酸殘基引起的熒光強度比正常皮膚組織高，這是腫瘤部位表皮細胞功能活躍或過度增殖所致；相反，在350 nm 激發(fā)光下，腫瘤部位與真皮的膠原蛋白交聯(lián)有關(guān)的熒光強度通常比正常組織低，這可能是腫瘤細胞釋放的酶導致結(jié)締組織的降解或侵蝕所致。此外，由于皮膚腫瘤血供相對豐富，血紅蛋白對熒光有吸收作用，在410 nm 激發(fā)光下，NMSC 患者病變部位的皮膚比周圍正常組織產(chǎn)生的熒光強度更低［31］。根據(jù)NMSC 部位和正常皮膚在上述波長位置產(chǎn)生熒光強度的不同，SAF 技術(shù)可幫助臨床醫(yī)師進行診斷。使用K-鄰近（K-nearest neighbor，K-NN）算法分析SAF光譜可以區(qū)分不同病因?qū)е碌馁樕曰蜓仔圆∽?，包括淺表BBC、結(jié)節(jié)性BCC、鮑恩病和銀屑病，均可達到92%以上的特異度和靈敏度；但此種算法需將未知光譜與已知光譜的數(shù)據(jù)庫進行比較，因此需要事先建立較大的數(shù)據(jù)庫方可獲得較高的準確度［32］。綜上，SAF 檢測技術(shù)可用于NMSC的輔助診斷。對于MM，Lihachev 等［33］發(fā)現(xiàn)其在405 nm發(fā)光二極管（light emitting diode，LED）照射下產(chǎn)生的SAF三原色（red green blue，RGB）圖像的熒光強度明顯低于BCC 和色素痣，但需要擴大臨床病例數(shù)確定其是否存在統(tǒng)計學差異。Wang 等［34］使用近紅外熒光成像對藍痣、脂溢性角化病、皮內(nèi)痣及惡性雀斑樣痣（MM 的癌前病變）進行分析發(fā)現(xiàn)，通過黑素熒光分布的不同特點可區(qū)分這幾類皮膚病。此外，Tamo?iūnas 等［35］研究皮膚癌術(shù)后瘢痕內(nèi)SAF 的增長趨勢，認為瘢痕SAF 的暫時減少可能是皮膚癌局部復發(fā)的標志，因此推測SAF 檢測可以應用于皮膚癌的長期隨訪和復發(fā)的早期評估。

除了單獨運用SAF 檢測技術(shù)診斷外，SAF 檢測也可聯(lián)合其他檢測方式以提高診斷的準確度。使用SAF 和δ-氨基酮戊酸誘導熒光相結(jié)合的雙光譜成像方法檢測得出的侵襲性BCC 的腫瘤邊界，比單獨使用δ-氨基酮戊酸誘導熒光成像更接近實際的腫瘤邊界［36］。使用SAF對PpⅨ熒光檢測進行歸一化處理后（靈敏度97%，特異度100%），對NMSC 定位的準確性比單獨使用PpⅨ熒光檢測明顯升高（靈敏度27%，特異度39%）［37］。而使用拉曼光譜、可見光激發(fā)的SAF 光譜和近紅外光激發(fā)的SAF 光譜等3種光譜聯(lián)合分析，通過對BCC、MM患者病變部位皮膚與正常皮膚的黑素、卟啉、黃素、脂質(zhì)和膠原蛋白含量等多項指標進行分類，可達到97.3%的分類準確率，適用于腫瘤的快速分類和大規(guī)模篩查［38］。Khristoforova等［39］同樣聯(lián)合SAF光譜及拉曼光譜，通過變量投影重要度（variable importance in projection，VIP）分析及偏最小二乘法（partial least square，PLS）回歸分析，可良好地區(qū)分MM、BCC 及其他皮膚良性腫瘤（皮膚纖維瘤、血管瘤、角化病等）。

5 有AEGs累積的其他系統(tǒng)的疾病

除皮膚病外，SAF 檢測技術(shù)可用于無創(chuàng)評估皮膚中AGEs 的累積以輔助其他系統(tǒng)疾病的診斷［40］。AEGs 是非酶糖基化反應的終產(chǎn)物，在組織中的累積與許多年齡相關(guān)的慢性疾病發(fā)展有關(guān)，如動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎功能衰竭、阿爾茨海默病等。SAF 檢測設備（如AGE-ReaderTM）通常使用300～420 nm 的激發(fā)光照射前臂的皮膚區(qū)域，并用分光光度計收集并檢測皮膚內(nèi)源性熒光團產(chǎn)生的420～600 nm 發(fā)射光的熒光強度，通過計算及標準化得出SAF 強度［41］。目前SAF 檢測在臨床中已運用在內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等系統(tǒng)疾病的診斷。例如，SAF 可用于糖尿病高危人群的風險分級，為糖尿病檢測提供評估工具［42］。AGEs 在腎臟病患者中也有累積，尤其與慢性腎臟疾病的預后相關(guān)［43］。急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）患者的SAF 低于慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者，并且與預期的腎衰竭持續(xù)時間有關(guān)，因此早期測量SAF 有助于區(qū)分AKI 和CKD［44］。SAF 還可作為心血管疾病高風險患者全因死亡率和心血管病死亡率的預測指標［45］。在神經(jīng)認知功能方面，輕度認知功能障礙患者的SAF 明顯高于正常認知功能受試者的SAF（2.56±0.55 vs 2.10±0.41，P<0.001），而高SAF（SAF>2.27）與輕度認知障礙存在顯著相關(guān)（odds=6.402，P=0.009）［46］，因此SAF 有望作為輕度認知障礙的診斷工具。另外，SAF 與尿液中可替寧N-氧化物（一種尼古丁暴露的生物標志物）的濃度呈正相關(guān)（β=0.06，P=0.03），可代替問卷作為簡易評估尼古丁暴露程度的工具［47］。在評估其他系統(tǒng)疾病時，SAF 主要作為AGEs 的定量評估工具，因此其應用均為AGEs 相關(guān)的疾病?？偠灾?，SAF 技術(shù)在評估AGEs的組織累積上已十分成熟，并且可在多系統(tǒng)疾病的診斷中發(fā)揮作用。

6 結(jié)語與展望

SAF 檢測技術(shù)具有無創(chuàng)、便捷、成本低等優(yōu)點，此外由于SAF 檢測不需要注射外源性熒光團（即光敏劑），可避免光敏劑類型及劑量選擇、光敏劑施加至檢測間隔時間的設定及光敏劑不良反應等問題［48］。但是，SAF 檢測目前仍有許多局限性：①不同性別及人體不同部位的SAF 強度基線不同［49］，因此需對不同性別及檢測部位的SAF 強度進行標準化。②皮膚表皮層的黑素及真皮層內(nèi)的血紅蛋白均會吸收熒光［24，26，50］，較深膚色（Fitzpatrick皮膚分型為Ⅴ型和Ⅵ型）的皮膚易吸收激發(fā)光使皮膚反射率（skin reflectance percentage，SR%）低于6，導致SAF 無法準確測量［32，41，43］，因此SAF 檢測的結(jié)果需要對皮膚色素沉著及發(fā)紅進行校正。③SAF 檢測還受護膚霜的影響，導致SAF 相關(guān)數(shù)值測量誤差升高和SR%降低，這可能是由于護膚霜吸收紫外線輻射保護皮膚的特性所致［51］。④內(nèi)源性熒光團的激發(fā)和發(fā)射光譜較寬，可能會出現(xiàn)光譜重疊使不同熒光團難以區(qū)分。盡管如此，SAF成像及熒光光譜技術(shù)仍在多種疾病的診斷上顯示出其特有的優(yōu)勢。例如：無創(chuàng)性操作及低成本可提高患者的接受度或治療后隨訪的依從性；在術(shù)前無需患者接受額外的光敏劑注射即可在術(shù)中指導術(shù)者腫瘤切除的范圍，減少醫(yī)患雙方圍術(shù)期的準備工作等。

目前SAF 檢測技術(shù)在臨床上尚未大規(guī)模應用，原因可能是采集病例數(shù)據(jù)庫較小、沒有一致的統(tǒng)計算法和缺乏統(tǒng)一的判定標準，使研究結(jié)果缺乏可推廣性。進一步擴大研究的樣本量并規(guī)范算法及陽性結(jié)果的判定標準仍然是未來需要解決的問題。隨著自體熒光檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和數(shù)據(jù)庫、算法、評判標準的不斷完善，SAF 檢測技術(shù)在疾病診斷中的應用會越來越廣。